韋 璐，孫欽菊，黃 杰，王艷娜，卓佩琳，黎玫崎，姚美金

（廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530007）

香蕉隸屬芭蕉科（Musaceae），富含碳水化合物、礦物質(zhì)和多種維生素，同時(shí)含有酚類、類黃酮等活性成分物質(zhì)，具有潤(rùn)腸通便、抗氧化等保健功效[1-2]。香蕉除鮮食外，還可作為原料生產(chǎn)加工成其他復(fù)合果汁飲料產(chǎn)品[3]。芒果隸屬漆樹科（Anacardiaceae）芒果屬（Meagifera），素有“熱帶果王”之稱[4]，其果肉細(xì)膩多汁，風(fēng)味獨(dú)特，富含糖，維生素A、B、C，胡蘿卜素以及人體必需的微量元素硒、鈣、磷、鉀等[5-6]。六堡茶屬黑茶，因產(chǎn)于廣西梧州六堡鎮(zhèn)而得名，據(jù)悉于清朝時(shí)，就以減肥、助消化、降脂等功效而聞名[7]。臨床研究表明，六堡茶具有降血脂、抗凝血、抗氧化[8-9]、調(diào)節(jié)腸道菌群等功效，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值[10]。

發(fā)酵型飲料以果蔬為原料通過(guò)微生物發(fā)酵釀制而成，其酒精含量在1%vol以下[11]，與普通飲料相比，不僅清涼、止渴，還較好地保存了其營(yíng)養(yǎng)素，達(dá)到調(diào)節(jié)人體生理功能的目的[12]。經(jīng)益生菌發(fā)酵所得飲料，是現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)在水果和乳制品混合原料深加工領(lǐng)域的具體應(yīng)用，對(duì)提升適口性、儲(chǔ)藏性和營(yíng)養(yǎng)性具有重要意義，符合當(dāng)前飲料的發(fā)展消費(fèi)趨勢(shì)，市場(chǎng)前景廣闊[13]。

該課題結(jié)合近年來(lái)流行的佰生優(yōu)益生菌產(chǎn)品，研究了以香蕉、芒果、六堡茶為原料，添加多種益生菌發(fā)酵，優(yōu)化了發(fā)酵工藝條件，開發(fā)出一款發(fā)酵風(fēng)味濃郁、口感酸甜爽口、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料，并跟蹤測(cè)定該飲料在發(fā)酵期間理化指標(biāo)和活性成分的含量，掌握其主要理化指標(biāo)和活性成分的變化規(guī)律，對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為發(fā)酵型香蕉果汁飲料工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉、芒果：南寧市廣百家超市；六堡茶（三級(jí)成品茶）：中國(guó)茶葉有限公司；果膠酶（1萬(wàn)U/g）：南寧東恒華道生物科技有限公司；佰生優(yōu)益生菌果蔬酵素發(fā)酵菌：昆山佰生優(yōu)生物科技有限公司；牛血清蛋白溶液（生物技術(shù)級(jí)）：Luminex公司；考馬斯亮藍(lán)G250（分析純）、沒(méi)食子酸（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SM-X電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海徐吉電氣有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；TM-767Ⅲ打漿機(jī)：中山市海盤電器有限公司；HWS-26水浴鍋：上海齊欣科學(xué)有限公司；VIS-7220N分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器有限公司；TDL-40B飛鴿牌系列離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料制備工藝流程

1.3.2 香蕉復(fù)合果汁飲料制備工藝操作要點(diǎn)

（1）香蕉漿及芒果汁的制備

原料選擇：選擇無(wú)褐變、無(wú)腐爛、表面無(wú)刮傷且結(jié)實(shí)的果實(shí)。

預(yù)處理：香蕉、芒果去皮切塊后稱質(zhì)量并記錄。

打漿：將預(yù)處理的果肉放入打漿機(jī)中打漿。

酶解：將香蕉、芒果漿分別置于燒杯中，加入0.3%果膠酶和0.3%糖化酶，用保鮮膜封口，置于恒溫為50 ℃的水浴鍋中酶解3 h。

過(guò)濾：將酶解的香蕉、芒果漿分別用過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾。

殺菌冷卻：過(guò)濾好的香蕉、芒果汁于85 ℃殺菌15 min，冷卻后于4 ℃條件下密封貯藏，備用。

（2）六堡茶湯的制備

醒茶：沸水醒茶。醒茶時(shí)，將熱水注入后盡快將水倒去，重復(fù)操作兩次，時(shí)間控制在3 s之內(nèi)。

泡茶：開水沖泡。將純水煮沸后，立即以1∶50的茶水質(zhì)量比進(jìn)行悶泡10 min，重復(fù)操作兩次。

過(guò)濾：悶泡結(jié)束后用四層紗布（100目）濾盡茶湯，合并兩次沖泡的茶湯。

殺菌冷卻：茶湯于85 ℃殺菌15 min，冷卻后于4 ℃條件下密封貯藏，備用。

1.3.3 香蕉復(fù)合果汁飲料制備工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以香蕉漿50%，芒果汁5.0%，白砂糖添加量6 g/100 mL為基礎(chǔ)配比，考察不同茶湯添加量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%）、發(fā)酵溫度（30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）、酵素接種量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料感官評(píng)分的影響。

1.3.4 香蕉復(fù)合果汁飲料制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素影響試驗(yàn)結(jié)果，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法對(duì)發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平見(jiàn)表1。

表1 香蕉復(fù)合果汁飲料發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for banana compound juice beverage fermentation optimization

1.3.5 感官評(píng)價(jià)

在已優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件下對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料進(jìn)行感官評(píng)分，通過(guò)感官評(píng)分值，驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性。選取10名經(jīng)過(guò)感官培訓(xùn)的人員，對(duì)發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料的狀態(tài)、色澤、氣味與口感進(jìn)行感官分析，并根據(jù)果汁的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（表2）進(jìn)行評(píng)分（滿分100分）。

表2 發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of fermented banana compound juice beverage

1.3.6 理化指標(biāo)測(cè)定

可溶性固形物測(cè)定：使用手持式阿貝折光儀測(cè)定；可滴定酸度測(cè)定：參照張莉麗等[14]可滴定酸度測(cè)定方法；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行測(cè)定[15]；總糖含量的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法測(cè)定[16]；總酚含量的測(cè)定：采用福林-酚（Folin-Ciocalteu）法測(cè)定[17]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Origin 9.1和Design Expert 10軟件進(jìn)行繪圖、數(shù)據(jù)處理及分析，采用Adobe Illustrator CS5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖表的修飾。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉復(fù)合果汁飲料制備工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 茶湯添加量對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料品質(zhì)的影響

茶湯添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著茶湯添加量的增加，復(fù)合果汁飲料的感官評(píng)分先增加后降低，當(dāng)六堡茶湯添加量為5.0%時(shí)，飲料的口感達(dá)到最佳狀態(tài)，既有香蕉汁及芒果汁的滋味和香氣又含有六堡茶的茶香，風(fēng)味、色澤協(xié)調(diào)，當(dāng)六堡茶湯添加量＞5.0%之后，茶味逐漸掩蓋住果汁的香氣和風(fēng)味，且飲料顏色發(fā)暗。故最佳茶湯添加量為5.0%。

圖1 茶湯添加量對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of tea soup addition on the quality of banana compound juice beverage

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料品質(zhì)的影響

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the quality of banana compound juice beverage

發(fā)酵溫度對(duì)飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著溫度升高，復(fù)合果汁飲料的感官評(píng)分先升高后降低。發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，復(fù)合果汁飲料的感官評(píng)分最高，此時(shí)飲料顏色淡黃透亮，具有較突出的香蕉汁及芒果汁的復(fù)合滋味和香氣。溫度較低時(shí)，菌體內(nèi)酶活性受到抑制，使得發(fā)酵產(chǎn)酸速率較慢，同時(shí)菌體的繁殖速率也會(huì)降低；溫度較高時(shí)，菌體的生長(zhǎng)受到抑制，菌體有可能遭到破壞，產(chǎn)生影響飲料品質(zhì)的物質(zhì)。因此，復(fù)合果汁飲料在32 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵口感最佳。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)飲料感官評(píng)分的影響較大，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，飲料顏色由深變淺，口感也慢慢變酸，繼而影響飲料糖酸比，掩蓋了香蕉汁及芒果汁獨(dú)有的香氣及滋味，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)飲料感官評(píng)分最高，且色澤淡黃透亮，香蕉及芒果的滋味和香氣濃郁，糖酸比適宜。復(fù)合果汁飲料發(fā)酵前期，菌體繁殖速度較快，發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)含量及酸度逐漸增加，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)酸量會(huì)逐漸增大，使得飲料偏酸，從而影響飲料口感。因此，復(fù)合果汁飲料的最佳發(fā)酵時(shí)間為5 d。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the quality of banana compound juice beverage

2.1.4 酵素接種量對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料品質(zhì)的影響

圖4 酵素接種量對(duì)香蕉復(fù)合果汁飲料品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of Jiaosu starter inoculum on the quality of banana compound juice beverage

酵素接種量對(duì)飲料品質(zhì)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，酵素接種量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響較小，無(wú)顯著變化趨勢(shì)，隨著發(fā)酵菌接種量增加，感官評(píng)分呈現(xiàn)先下降后上升并趨于平穩(wěn)，且復(fù)合果汁飲料色澤、氣味、口感并無(wú)明顯變化，考慮成本問(wèn)題，佰生優(yōu)益生菌果蔬酵素最佳接種量為0.04%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

表3 香蕉復(fù)合果汁飲料發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of response surface methodology for banana compound juice beverage fermentation conditions optimization

結(jié)果顯示，各因素最佳條件為：茶湯添加量5.0%、發(fā)酵時(shí)間5 d、發(fā)酵溫度32 ℃。采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，利用Design Expert軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，建立以茶湯添加量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）為自變量的多元回歸方程：

通過(guò)Design-Expert 10軟件進(jìn)行方差分析來(lái)驗(yàn)證回歸模型及各參數(shù)的顯著性，對(duì)得出的方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。由表4可知，模型P＜0.01，說(shuō)明本試驗(yàn)選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性。失擬項(xiàng)P＞0.05（P=0.788 0）不顯著，表明感官評(píng)價(jià)的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值有很好的擬合度，可以用該模型方程來(lái)分析和預(yù)測(cè)不同發(fā)酵工藝條件下香蕉復(fù)合果汁飲料的感官評(píng)分。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology

2.3 響應(yīng)面分析及最優(yōu)發(fā)酵工藝條件的確定

對(duì)表3回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果中存在顯著交互作用的交互項(xiàng)作響應(yīng)曲面圖直觀分析，可以進(jìn)一步研究各因素間交互作用的強(qiáng)弱，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著各因素水平的增加，感官評(píng)分均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，并且響應(yīng)面形狀陡峭，說(shuō)明兩者的交互效應(yīng)顯著，這與方差分析結(jié)果相一致。

進(jìn)一步用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，以獲得最優(yōu)的發(fā)酵工藝參數(shù)。經(jīng)分析可知最優(yōu)參數(shù)為：茶湯添加量4.9%，發(fā)酵時(shí)間5.1 d，發(fā)酵溫度33.6 ℃。

圖5 各因素交互作用對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each two factors on sensory score

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否與真實(shí)情況相一致，根據(jù)上述結(jié)果進(jìn)行近似驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件定為：茶湯添加量5.0%，發(fā)酵時(shí)間5.0 d，發(fā)酵溫度34 ℃。在此條件下進(jìn)行多次平行試驗(yàn)，得出的實(shí)際感官評(píng)分（90分）與理論預(yù)測(cè)值（89.9分）相近，此時(shí)香蕉復(fù)合果汁飲料色澤淡黃透亮、具有香蕉和芒果固有的濃郁香味，酸甜適中、香氣清新，因此選取此條件為香蕉復(fù)合果汁飲料的最佳工藝參數(shù)。

2.5 營(yíng)養(yǎng)活性成分分析

2.5.1 可溶性固形物隨發(fā)酵時(shí)間的變化

圖6 發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料可溶性固形物含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.6 Changes of soluble solids content in fermented banana compound juice beverage with fermentation time

由圖6可知，可溶性固形物可大致表示飲料的含糖量，發(fā)酵第1天可溶性固形物含量下降細(xì)微，發(fā)酵第3天含量上升，這可能是微生物對(duì)香蕉芒果漿進(jìn)行分解導(dǎo)致其中的可溶性多糖溶于發(fā)酵液中，從而使發(fā)酵液中糖含量上升，可溶性固形物含量也因此上升，發(fā)酵第4天含量下降，原因可能是佰生優(yōu)益生菌大量繁殖將飲料中的糖消耗所致，可溶性固形物含量總體呈上升趨勢(shì)。

2.5.2 可滴定酸度隨發(fā)酵時(shí)間的變化

圖7 發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料可滴定酸度隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.7 Changes of titratable acidity in fermented banana compound juice beverage with fermentation time

由圖7可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)合果汁飲料可滴定酸度含量呈上升趨勢(shì)，這可能是香蕉復(fù)合果汁飲料中添加的佰生優(yōu)益生菌果蔬酵素代謝活動(dòng)產(chǎn)生酸性物質(zhì)所致。佰生優(yōu)益生菌包含植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌，主要發(fā)酵產(chǎn)物為酸性物質(zhì)，在復(fù)合果汁飲料中添加的佰生優(yōu)益生菌果蔬酵素發(fā)酵菌，加快了果汁飲料的發(fā)酵速度，因此隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，飲料的酸性物質(zhì)逐漸增加，若其酸度過(guò)高，即影響飲料口感，需合理控制發(fā)酵時(shí)間。

2.5.3 蛋白質(zhì)含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化

圖8 發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料蛋白質(zhì)含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.8 Changes of protein content in fermented banana compound juice beverage with fermentation time

由圖8可知，發(fā)酵前2 d蛋白質(zhì)含量呈明顯上升趨勢(shì)，可能是復(fù)合果汁飲料在益生菌作用下分解，使蛋白質(zhì)融溶入發(fā)酵液中，這與文獻(xiàn)[18]報(bào)道中蛋白質(zhì)變化趨勢(shì)一致。而發(fā)酵后3 d其含量處于相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)，輕微下降可能是少量蛋白質(zhì)與單寧類物質(zhì)結(jié)合形成沉淀所致。

2.5.4 總糖含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化

圖9 發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料總糖含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.9 Changes of total sugar content in fermented banana compound juice beverage with fermentation time

由圖9可知，發(fā)酵過(guò)程中香蕉復(fù)合果汁飲料總糖含量并沒(méi)有太大變化，發(fā)酵第1天由10.67 g/100 g降至10.07 g/100 g，這可能是由于佰生優(yōu)益生菌大量繁殖將飲料中的糖代謝成酸性物質(zhì)，含量隨后上升，原因可能是微生物對(duì)香蕉芒果漿進(jìn)行分解導(dǎo)致其中的可溶性多糖溶于發(fā)酵液中，從而使發(fā)酵液中的總糖含量上升[13，19]。

2.5.5 總多酚含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化

圖10 發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁總多酚含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.10 Changes of total polyphenols content in fermented banana compound juice beverage with fermentation time

由圖10可知，多酚含量與飲料的保健作用和品質(zhì)密切相關(guān)，多酚含量呈現(xiàn)先上升后下降且趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，發(fā)酵第1天總多酚含量上升至0.50 mg/mL，其原因可能是佰生優(yōu)益生菌發(fā)酵過(guò)程中能使結(jié)合多酚得以釋放，從而提高飲料中游離態(tài)多酚化合物含量[20]。隨后其含量在0.30 mg/mL上下波動(dòng)且波動(dòng)幅度較小，可能是多酚類物質(zhì)氧化聚合或與蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞殘余物結(jié)合形成沉淀所致[21]。復(fù)合果汁飲料經(jīng)發(fā)酵后，對(duì)總多酚的含量影響并不顯著，保留了香蕉復(fù)合果汁飲料原有的獨(dú)特風(fēng)味。

2.6 發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料總體評(píng)價(jià)

在最佳發(fā)酵工藝條件下，釀制的香蕉復(fù)合果汁飲料，其可溶性固形物含量為16.80%，可滴定酸度含量為1.20 g/kg，蛋白質(zhì)含量為10.90 mg/100 g，總糖含量為9.91 g/100 g，總多酚含量為0.38 mg/mL，且飲料色澤淡黃透亮、具有香蕉和芒果固有的濃郁香味，酸甜適中、香氣清新。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以香蕉、芒果、六堡茶湯為主要原料，佰生優(yōu)益生菌果蔬酵素發(fā)酵菌為發(fā)酵菌種，通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化以及營(yíng)養(yǎng)成分分析，研制生產(chǎn)出發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁飲料。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵工藝條件為香蕉漿50%，芒果汁5%，白砂糖添加量6%、佰生優(yōu)益生菌果蔬酵素接種量0.04%、茶湯添加量5.0%，發(fā)酵時(shí)間5.0 d，發(fā)酵溫度34 ℃，此條件下得到的香蕉復(fù)合果汁飲料色澤淡黃透亮、具有香蕉和芒果固有的濃郁香味，酸甜適中、香氣清新，其可溶性固形物、可滴定酸度、蛋白質(zhì)、總糖、總多酚的含量分別為16.80%、1.20 g/kg、10.90 mg/100 g、9.91 g/100 g、0.38 mg/mL。在飲料發(fā)酵過(guò)程中，總糖和總多酚含量變化較小，處于穩(wěn)定狀態(tài)，這表明發(fā)酵型香蕉復(fù)合果汁中所含有的總糖以及總多酚含量得以保留，而可滴定酸度和蛋白質(zhì)含量呈上升狀態(tài)，這可能是添加的佰生優(yōu)益生菌果蔬酵素發(fā)酵菌代謝活動(dòng)所致，有助于香蕉復(fù)合果汁飲料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的提高。