■劉 婕 余保寧 李 理 張妮婭 齊德生*

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510641；2.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州511356；3.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，湖北武漢430070）

據(jù)世界糧農(nóng)組織估計，目前世界范圍內(nèi)至少有25%的農(nóng)作物受到了真菌毒素的污染[1]，其中黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）的污染最嚴重。不同的飼料原料被黃曲霉毒素污染的程度會有差別，如同為能量飼料的玉米和小麥，玉米更容易被AF污染；且同為蛋白質飼料的豆粕和花生粕，花生粕更易被AF污染[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在油料種子中AF 的污染要更嚴重[2]，Mellon 等[3]發(fā)現(xiàn)，在玉米胚中A. flavus產(chǎn)生AFB1的量遠遠高于玉米胚乳中的產(chǎn)毒量。且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，除了油脂含量能顯著影響AFB1合成以外，飼料原料基質成分的差異也會造成AF污染水平的不同[2，4]。天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、水蘇糖和鋅能夠明顯地刺激AFB1產(chǎn)生，而銅、鐵和錳不利于黃曲霉產(chǎn)生AFB1。隨著可溶性糖、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和丙氨酸添加量增加，均能明顯促進黃曲霉菌絲生長（P＜0.05）；而鋅、鐵和錳均能促進黃曲霉菌絲生長，但是銅明顯抑制黃曲霉菌絲生長（P＜0.05）[4]。目前的研究基本闡明了不同的飼料原料被AF污染存在差異性主要是由飼料中的營養(yǎng)成分的種類和含量所決定的，但這些營養(yǎng)成分的調(diào)控機制是什么，還需要進一步研究。因此本研究在課題組前期試驗結果的基礎上，選取對A. flavus產(chǎn)毒和生長影響較大的營養(yǎng)成分及水平，研究其對AF 生物合成過程中的關鍵基因（aflP、aflS、aflD、aflM和aflP）的表達情況的影響。從而揭示飼料中不同營養(yǎng)成分對A. flavus產(chǎn)毒影響的作用機制。本研究結果將對指導飼料生產(chǎn)以及控制飼料AFB1污染提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃曲霉產(chǎn)毒菌株（Aspergillus flavusNRRL-3357）由中山大學賀竹梅教授實驗室贈送。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Detrose Agar，PDA）（青島海博生物技術有限公司）。DNA Marker（大連寶生物）、瓊脂糖（Biowest，法國）、TRizol 試劑（Invitrogin，美國）、反轉錄試劑盒（Takara，日本）、RNase Inhibitor（Vazyme Biotech，美國）、Premix Taq（Takara，日本）、iTaq Universal SYBR Green Super mix（Bio-Rad，美國）。本試驗用到的所有化學試劑無特殊說明均為分析純。

試驗所用的基礎培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基：0.3%NaNO3、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4·7H2O、0.05% KCl、0.001% FeSO4·7H2O和3.0% 蔗糖。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株保存活化及孢子懸浮液的制備

將A. flavusNRRL-3357菌株保存在20%甘油中，然后保藏于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)研究。待用時，將保存的菌株在PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)7 d。然后在培養(yǎng)皿中加入約20 ml孢子洗滌液（含有0.05% 吐溫-80的無菌生理鹽水）[5]，用無菌棉棒輕輕洗下黃曲霉孢子，然后將含有孢子的洗滌液經(jīng)過4層無菌紗布過濾，收集濾液于含有玻璃珠的無菌藍蓋試劑瓶中，振蕩搖勻，讓孢子均勻分布在孢子洗滌液中。吸取適量的孢子液小心置于血球計數(shù)板（25×16）的計數(shù)室內(nèi)，蓋上蓋玻片，靜置片刻，在顯微鏡下計數(shù)。然后將孢子液稀釋到需要的濃度備用[6]。

1.2.2 菌絲體的收集

參考前期研究的結果[4]及國內(nèi)外研究數(shù)據(jù)，選擇可溶性糖：蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水蘇糖；氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸；微量元素：鋅（七水硫酸鋅ZnSO4·7H2O）和銅（五水硫酸銅CuSO4·5H2O）作為試驗材料?？扇苄蕴堑奶砑恿繛?.0、3.0 g/100 ml；氨基酸的添加量為0.5 g/100 ml；微量元素的添加量為50 mg/l。用6.0 mol/l的鹽酸和5.0 mol/l的NaOH將每組培養(yǎng)基的pH 值調(diào)至6.0。然后將培養(yǎng)基分裝到100 ml 三角瓶中，每個三角瓶中培養(yǎng)基的體積為30 ml。用透氣封口膜封口后121 ℃高溫高壓滅菌20 min，待冷卻至室溫后，接種100 μl 黃曲霉孢子菌懸液（1×108個/ml）混勻，將三角瓶用透氣封口膜封口之后置于氣浴搖床中培養(yǎng)3 d 和5 d，培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖床轉速為150 r/min。培養(yǎng)結束后將三角瓶中的培養(yǎng)基和菌絲體通過濾紙過濾，收集菌絲體，菌絲體保存于-80 ℃用于基因表達量的測定。每組5個重復。

1.2.3 AFB1合成相關基因表達量測定

總RNA 的 提 取 采 用TRIzol Reagent（InvitrogenTM, USA），并參考曾麗梅[7]的方法。RNA 反轉錄使用的是Takara PrimeScript反轉錄試劑盒，反轉錄反應條件：37 ℃15 min；85 ℃5 s；結束后保持4 ℃。

1.2.4 Real-time PCR基因表達量的檢測

1.2.4.1 引物設計

利用Primer 5.0引物分析軟件分別設計此次試驗所用的特異性上下游引物，beta-tubulin基因作為內(nèi)參基因。引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成。將凍干粉狀態(tài)的引物用超純水配置成10 μmol/l的工作溶液，-20 ℃保存。各引物序列如表1所示。

1.2.4.2 cDNA質量檢測

將提取的總RNA 進行反轉錄后，通過PCR 擴增檢測反轉錄得到的cDNA 的質量。并對設計的引物用cDNA進行PCR擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的產(chǎn)物。

表1 試驗所涉及的引物

PCR 反應程序：98 ℃，5 min；98 ℃，10 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s；72 ℃，10 min；40 個循環(huán)，反應結束后保持在4 ℃。

1.2.4.3 Real-time PCR

確定了模板cDNA 和各對引物的質量后，Realtime PCR 試驗使用BIO-RAD 公司的iTaq Universal SYBR Green Supermix，在BIO-RAD CFX 系列Realtime PCR檢測系統(tǒng)上完成。

反應程序：95 ℃，4 min；95 ℃，10 s；57 ℃，10 s；72 ℃，20 s；40 個循環(huán)。熔解曲線條件：55 ℃升溫至93.5 ℃，每0.5 ℃讀5 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

圖1 可溶性糖對AFB1合成關鍵基因表達量的影響（5 d）

本試驗的數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理之后，結果按照“平均值±標準差（SD）”的方式表示。然后利用SPASS 22.0（Chicago，USA）軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析。使用Duncan′s 檢驗對各處理組間平均值進行多重比較，P＜0.05為差異顯著?；虻南鄬Ρ磉_量用2-△△Ct方法進行計算。

2 結果

本試驗研究了不同的營養(yǎng)成分對AF合成過程中相關基因表達的影響。試驗選擇了5個關鍵基因，分別是AF 合成過程中最關鍵的兩個調(diào)節(jié)基因aflP和aflS，以及3 個結構基因aflD、aflM和aflP，這3 個結構基因分別代表了AF合成的前、中、后期3個階段。

2.1 可溶性糖對AF合成中關鍵基因表達的影響（見圖1）

根據(jù)前期試驗結果，由于果糖和棉子糖對AFB1 合成的促進作用不如其它4 種可溶性糖明顯，所以選擇了蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水蘇糖作用試驗材料，而且1.0%和3.0%的可溶性糖對黃曲霉產(chǎn)毒的影響差異很明顯，所以本試驗選擇1.0%和3.0%兩個濃度。在培養(yǎng)5 d 時，4 種可溶性糖對AF合成相關基因的表達的影響見圖1。相比于1.0%的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和水蘇糖，當這4 種可溶性糖的含量增加到3.0%時，能明顯促進基因aflS、aflD、aflM和aflP的表達，同時3.0%葡萄糖（P＜0.01）和水蘇糖（P＜0.001）也顯著促進了aflP基因的表達。對于蔗糖、葡萄糖和麥芽糖，基因aflP表達量增加最為明顯，增加了近百倍，而在水蘇糖中基因aflS的表達量增加最為明顯。

2.2 氨基酸對AF 合成中關鍵基因表達的影響（見圖2～圖3）

圖2 天冬氨酸（A）、谷氨酸（B）、精氨酸（C）對AFB1合成關鍵基因表達量的影響（5 d）

圖3 天冬氨酸（A）、谷氨酸（B）、精氨酸（C）對AFB1合成關鍵基因表達量的影響（3 d）

根據(jù)前期試驗結果得知，由于丙氨酸和甘氨酸對AFB1 合成的促進作用不如天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸明顯，所以選擇了0.5%天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸進行研究。3 種氨基酸對AF 合成相關基因的表達見圖2（培養(yǎng)5 d）。培養(yǎng)5 d時，天冬氨酸對AF合成中5個關鍵基因的表達有一定促進作用，但差異不顯著；而在培養(yǎng)3d時，天冬氨酸可以明顯促進這5個關鍵基因的表達，見圖3A。培養(yǎng)5 d 時，谷氨酸明顯提高了基因aflP、aflD和aflM的表達量（P＜0.05），同時對基因aflS和aflP的表達也有一定的促進作用，差異不顯著；但在培養(yǎng)3 d 時，谷氨酸顯著上調(diào)了基因aflP的表達（P＜0.01），見圖3B。同樣在培養(yǎng)5 d時，精氨酸可以顯著提高調(diào)節(jié)基因aflP（P＜0.05）和aflS（P＜0.001）的表達量，但是同時也抑制了基因aflD、aflM和aflP的表達（P＜0.01），而在培養(yǎng)3 d 時精氨酸對基因aflD、aflM和aflP的表達有一定的促進作用見圖3C。

2.3 銅和鋅對AF 合成過程中關鍵基因表達的影響（見圖4～圖5）

圖4 鋅和銅對AFB1合成關鍵基因表達量的影響（5 d）

圖5 鋅和銅對AFB1合成關鍵基因表達量的影響（3 d）

根據(jù)課題組前期的試驗結果，鋅能夠明顯促進AFB1合成，銅不僅顯著抑制了AFB1合成還抑制了黃曲霉菌絲生長，所以選擇50 mg/l 的鋅和銅作為研究對象。鋅和銅對AF合成相關基因的表達見圖4（培養(yǎng)5 d）。與對照組相比，鋅明顯抑制了基因aflS、aflD、aflM和aflP的表達，同時銅明顯抑制aflP、aflS、aflD、aflM和aflP基因的表達。雖然在培養(yǎng)5 d 后，鋅對AF合成關鍵基因的表達都是抑制狀態(tài)，但是在培養(yǎng)3 d時，鋅能夠極顯著地促進這5 個關鍵基因的表達（P＜0.001），尤其是基因aflP，表達量上調(diào)200 多倍，見圖5A；銅依然顯著抑制了基因aflP和aflS的表達見圖5B。

3 討論

AF生物合成的初始階段類似于脂肪酸的生物合成，即乙酰CoA（Acetyl-CoA）作為其起始單位，而丙二酸單酰CoA作為延長單位，在聚酮化合物合成酶的催化作用下形成AF 的聚酮骨架[8-10]。AF 的生物合成調(diào)控是一個復雜的多個途徑相互作用的過程，AF 合成通路基因成簇排列在70 kb的DNA序列上，其序列上包含了25個已定義明確的基因[11]。如基因aflP和aflS是AF 合成基因簇中相鄰的兩個調(diào)節(jié)基因，直接調(diào)控著AF 和ST（sterigmatocystin）的合成。aflD基因編碼的酮還原酶，可以將NOR（norsolorinic acid）轉化為AVN(averantin)[12]；aflM參 與DMST（demethyl-sterigmatocystin）的合成[13]；aflP參與ST 到OMST（O-methylsterigmatocystin）以及DMST 到DHOMST（dihydro-demethyl-sterigmatocystin）的轉化過程[14]?；騛flD、aflM、aflP分別代表了AF 合成途徑中的前中后段[15]。因此，本試驗一共選取這5個關鍵基因作為代表來研究這些營養(yǎng)元素對AF合成相關基因表達的影響。

天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、水蘇糖和鋅能夠明顯地刺激AFB1產(chǎn)生，而銅不利于黃曲霉產(chǎn)生AFB1[4]。本試驗選擇了1.0%和3.0%的蔗糖、果糖、麥芽糖和水蘇糖作為研究對象。結果表明，3.0%的可溶性糖都能明顯促進aflS、aflD、aflM和aflP基因的表達，3.0%葡萄糖和水蘇糖促進了aflP基因的表達，但是蔗糖和麥芽糖中aflP基因的表達卻受到了抑制，可能是因為末端產(chǎn)物（AF）積累過多從而反饋阻遏了aflP基因的表達。本試驗選擇了0.5%的天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸作用試驗材料。培養(yǎng)5 d時，天冬氨酸對AF合成中5個關鍵基因的表達有一定的促進作用，但是差異不顯著；谷氨酸明顯提高基因aflP、aflD和aflM的表達量，但基因aflS和aflP差異不顯著，精氨酸顯著提高調(diào)節(jié)基因aflP和aflS的表達量，同時抑制了基因aflD、aflM和aflP的表達。但是在培養(yǎng)3 d時，AFB1在培養(yǎng)基中還沒有大量積累，3種氨基酸均明顯刺激了5 個關鍵基因（aflP、aflS、aflD、aflM、aflP）的表達。同樣，這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在了微量元素的試驗中，培養(yǎng)5 d 時鋅明顯抑制了基因aflS、aflD、aflM和aflP的表達，但是在培養(yǎng)3 d時，鋅極顯著地促進了這5 個關鍵基因的表達。這個現(xiàn)象也進一步證實了AFB1 的積累會反饋阻遏AF 合成相關基因的表達，這種反饋阻遏首先是抑制結構基因的表達，然后再抑制調(diào)節(jié)基因的表達。銅不利于AFB1 的合成[4]，首先是抑制了兩個調(diào)節(jié)基因aflP和aflS的表達，然后再抑制結構基因的表達。本試驗結果表明，這些營養(yǎng)元素通過促進關鍵基因的表達，從而加強AFB1合成，其中對結構基因aflM和aflP影響尤為顯著，同時調(diào)節(jié)基因aflP和aflS在AFB1合成過程中起關鍵作用。

4 結論

不同飼料原料中AFB1污染存在差異是由各種成分共同作用的結果，因此，通過調(diào)控原料中單一營養(yǎng)成分來控制飼料原料中AFB1的污染很難實現(xiàn)?？扇苄蕴?、氨基酸和微量元素均可通過對AF 合成關鍵基因（aflP、aflS、aflD、aflM、aflP）不同程度的上調(diào)，從而促進AFB1 合成。所以可以尋求物理、化學或生物的方法，抑制AF 合成調(diào)節(jié)基因（aflP、aflS）的表達，從而控制黃曲霉毒素的污染。