p21在滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲中的作用研究

王艷,趙楠楠,何艷舫,董建新,陳燕

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院,唐山 063000)

絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous trophoblast,EVT)侵入母體蛻膜對于胎盤植入和胎兒發(fā)育至關(guān)重要,該過程的失敗與多種妊娠疾病有關(guān),比如子癇前期(preeclampsia,PE)。PE的病理生理學(xué)與細(xì)胞功能障礙密切相關(guān),包括細(xì)胞增殖失調(diào)、凋亡增加、分化缺陷、滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入減弱以及氧化應(yīng)激[1-2]。PE的全球患病率約為8%,是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一。盡管已對PE進(jìn)行了數(shù)十年的研究,對其詳細(xì)的病理生理和分子機(jī)制仍知之甚少。

細(xì)胞周期進(jìn)程的平衡和控制需要通過不同的調(diào)控因子來確保。p21是周期素依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)抑制劑,由CDKN1A基因編碼。作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的重要成員,p21在很多生理過程中都發(fā)揮了重要的作用,例如:參與細(xì)胞周期調(diào)控、包括有絲分裂、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、分化、細(xì)胞骨架動力學(xué)、細(xì)胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的重新變成、衰老及衰老起始等[3]。在與癌癥有關(guān)的多項(xiàng)研究中,p21被證實(shí)不僅能抑制癌癥,還能作為原癌基因發(fā)揮致癌能力。然而,目前關(guān)于p21在胎盤學(xué)中的調(diào)節(jié)功能還研究的較少。有證據(jù)表明,在整個(gè)正常妊娠期內(nèi),p21基因都能在包括EVT在內(nèi)的多種滋養(yǎng)細(xì)胞類型中表達(dá),調(diào)控其增殖、分化和侵襲。因此,p21被認(rèn)為是細(xì)胞周期停滯,衰老和凋亡的潛在標(biāo)志物之一[4-5]。

本研究希望通過敲低滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo中的p21,來探究p21對正常滋養(yǎng)細(xì)胞運(yùn)動能力的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

HTR-8/SVneo細(xì)胞與BeWo細(xì)胞由本院研究室提供。

1.1.2 試劑

靶向p21的siRNA(F:ACACCUCCUCAUGU ACAUA,R:UAUGUACAUGAGGAGGUGU;命名為sip21)、對照siRNA以及絲裂霉素C均購自Sigma-Aldrich公司;GAPDH(GTX627408,1∶1000)的抗體購自Genetex;p53(sc-126,1∶1000)的抗體購自Santa Cruz Biotechnology;p21(#2947,1∶1500)、ERK3(#4067,1∶1000)以及PARP(#9542,1∶1000)的抗體均購自Cell Signaling;CellTiter細(xì)胞活力檢測試劑盒、總RNA提取試劑盒以及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司;GAPDH、p21、ERK3、MMP2的反轉(zhuǎn)錄引物由生工生物工程股份有限公司合成;RPMI培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素均購自生工生物工程股份有限公司。所用引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染

正常人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/Svneo與人絨毛膜癌細(xì)胞BeWo分別接種于含5%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100μmol/L鏈霉素的RPMI-1640(標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基)中進(jìn)行培養(yǎng)。融合前經(jīng)胰蛋白酶消化,然后在5%CO2、37℃環(huán)境下連續(xù)傳代培養(yǎng)。

用轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine對10～20 nmol/L siRNA進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染采用電穿孔法(250 V,250μF,500Ω)。

1.2.2 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):按照細(xì)胞活力檢測試劑盒制造商的說明進(jìn)行細(xì)胞增殖測定。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):將HTR8/SVneo細(xì)胞以2.0×105個(gè)/孔的濃度接種在24孔板中并培養(yǎng)過夜。融合成單層狀態(tài)時(shí),用絲裂霉素C處理細(xì)胞,抑制增殖。劃動移液槍尖端制造劃痕,24 h后觀察并用Image J分析劃痕愈合情況。

Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn):按照細(xì)胞侵襲檢測試劑盒制造商的說明,進(jìn)行細(xì)胞侵襲測定。簡單說來,先將500μL無血清培養(yǎng)基添加到Transwell的上室中,再將HTR8/SVneo細(xì)胞以7.5×104個(gè)/孔的濃度接種到培養(yǎng)基中,并在下室中加入750μL無血清培養(yǎng)基。16 h后,去除下室中的培養(yǎng)基,添加含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基,開始侵襲測定。24 h后,用甲醇固定侵襲的細(xì)胞,并用結(jié)晶紫染色。用顯微鏡對侵襲的細(xì)胞進(jìn)行成像分析,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

按照總RNA提取試劑盒制造商的說明提取總RNA,并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒制造商的說明對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,使用ABI StepOnePlus Real-time PCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件如下:

使用StepOne Software v2.2.2分析數(shù)據(jù),通過2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.2.4 蛋白印記分析(Western Blot)

先使用RIPA緩沖液和蛋白酶抑制劑制備細(xì)胞裂解物,然后采用Bio-Rad法測量蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE分離總蛋白并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,將膜用5%BSA在4℃下過夜封閉,與各一抗在室溫下孵育1.5 h,用PBS將膜沖洗3次,然后與二抗在室溫下孵育1 h,再用PBS沖洗3次。以GAPHD作為內(nèi)參,使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測各蛋白表達(dá)。使用Image J對蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較。當(dāng)P<0.05時(shí),被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p21和p53在滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)

由圖1所示,與人絨毛膜癌細(xì)胞株BeWo結(jié)果相反,在mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平上,正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/SVneo細(xì)胞p53的表達(dá)水平較高,而p21表達(dá)則都較低(P<0.05)。說明滋養(yǎng)細(xì)胞p21及其主調(diào)控因子p53的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上相互對應(yīng),二者在正常滋養(yǎng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出相反的表達(dá)水平。

2.2 細(xì)胞增殖

為了探究p21在滋養(yǎng)細(xì)胞增殖中的作用,用針對p21的siRNA(sip21)在HTR細(xì)胞中敲低了p21的表達(dá),然后進(jìn)行48 h的細(xì)胞活力分析。與對照siRNA(siCtrl)相比,用sip21處理的細(xì)胞在增殖上無顯著差異(P>0.05,圖2A)。PARP是細(xì)胞凋亡核心成員半胱天冬酶(caspase)的切割底物,可作為凋亡的標(biāo)志此外。用免疫印跡分析檢查了PARP及其裂解產(chǎn)物,結(jié)果在p21敲低的細(xì)胞與對照組細(xì)胞之間也未觀察到顯著差異(圖2B)。這說明p21可能對正常滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和凋亡沒有顯著影響。

2.3 細(xì)胞遷移

為了探究p21對正常滋養(yǎng)細(xì)胞運(yùn)動的影響,進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來觀察p21敲低后,滋養(yǎng)細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果顯示,與對照組相比,p21敲低后的滋養(yǎng)細(xì)胞遷移率顯著降低(圖3,P<0.05)。說明p21能影響正常滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移能力。

2.4 細(xì)胞侵襲

通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn),觀察p21敲低后正常滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果顯示,與對照相比,p21敲低后的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力顯著降低(圖4,P<0.05),說明p21能影響正常滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。

圖1 正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/SVneo與人絨毛膜癌細(xì)胞BeWo中p21和p53的表達(dá)Note.A,Results of qPCR.B,Results of Western Blot.Compared with HTR8/SVneo,?P<0.05.Figure 1 Expression of p21 and p53 in HTR8/SVneo and BeWo cells

圖2 HTR8/SVneo細(xì)胞增殖及凋亡Note.A,Cell viability.B,Expression of PARP in HTR8/SVneo by Western Blot.Figure 2 Proliferation and apoptosis of HTR8/SVneo

圖3 HTR8/SVneo細(xì)胞遷移能力變化Note.Compared with siCtrl,?P<0.05.(The same in the following figures)Figure 3 Change of HTR8/SVneo cell migration

圖4 HTR8/SVneo細(xì)胞侵襲能力變化Figure 4 Change of HTR8/SVneo cell invasion

2.5 ERK3的表達(dá)水平

ERK3是有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)超家族的遠(yuǎn)親成員,參與細(xì)胞的分化和遷移。為了探究p21影響滋養(yǎng)細(xì)胞運(yùn)動能力的可能機(jī)制,分別檢測了p21敲低后ERK3在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的變化。結(jié)果表明,與對照組比較,在p21敲低的滋養(yǎng)細(xì)胞中,ERK3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著降低(圖5,P<0.05)。說明p21可能通過調(diào)控ERK3相關(guān)信號路徑來影響滋養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)動能力。

2.6 MMP2 mRNA的表達(dá)水平

基質(zhì)金屬蛋白酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),因此滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)密切相關(guān)。其中,MMP2被認(rèn)為是在滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲過程中的關(guān)鍵酶,且受ERK3表達(dá)的影響。通過qPCR和Western Blot檢測了p21敲低后MMP2在mRNA和蛋白質(zhì)水平的變化。結(jié)果顯示,與對照組比較,MMP2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著降低(圖6,P<0.05)。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了p21可能通過調(diào)控ERK3/MMP2信號路徑來影響滋養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)動能力。

圖5 p21和ERK3在mRNA和蛋白質(zhì)上平上的的表達(dá)Note.A,Results of qPCR.B,Results of Western Blot.Figure 5 Expression of p21 and ERK3 at mRNA and protein levels

圖6 MMP2在mRNA和蛋白質(zhì)上平上的的表達(dá)Note.A,Results of qPCR.B,Results of Western Blot.Figure 6 Expression of MMP2 at mRNA and protein levels

3 討論

p21在細(xì)胞運(yùn)動中的作用是多方面的,取決于不同的細(xì)胞環(huán)境。核p21能作為轉(zhuǎn)錄因子/輔因子,在轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲有必不可少的作用,當(dāng)其基因被沉默后,雖然對細(xì)胞生長和增殖沒有顯著影響,但能抑制乳腺脂肪墊異種移植小鼠和其他多種乳腺癌細(xì)胞的侵襲。Dai等[6]指出p21的高表達(dá)與促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移/侵襲進(jìn)而降低乳腺癌患者的存活率有關(guān)。Qian等[7]關(guān)于腫瘤小鼠模型的研究則發(fā)現(xiàn),腫瘤的侵襲伴隨著p21的上調(diào),而p21基因敲除的小鼠,其腫瘤轉(zhuǎn)移受到明顯的抑制,當(dāng)p21重新表達(dá)后,該抑制現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)。細(xì)胞質(zhì)p21被發(fā)現(xiàn)能通過抑制Rho/ROCK/LIM途徑來促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的運(yùn)動能力[8]。也有報(bào)道指出,細(xì)胞質(zhì)p21和p53的復(fù)合物能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制侵襲[9]。同時(shí),滋養(yǎng)細(xì)胞必須在侵襲過程發(fā)生之前就結(jié)束細(xì)胞周期,包括p21的激活[10]。

本研究的結(jié)果顯示,p21的敲低造成了正常滋養(yǎng)細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的減弱,但對細(xì)胞增殖或凋亡誘導(dǎo)則無影響。與對照相比,p21敲低的滋養(yǎng)細(xì)胞遷移率顯著降低,僅為53%(P<0.05),而侵襲細(xì)胞的數(shù)量則比對照減少了21%(P<0.05)。此外,在p21敲低的滋養(yǎng)細(xì)胞中,EKR3不論在mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)都顯著降低,這提示了滋養(yǎng)細(xì)胞運(yùn)動能力和侵襲能力的減弱可能在一定程度上是由減少ERK3的表達(dá)來介導(dǎo)的。ERK3在細(xì)胞增殖,細(xì)胞周期進(jìn)程和分化中都發(fā)揮了作用。ERK3可以激活其第一個(gè)被鑒定的底物PRAK,從而影響肌動蛋白的重塑和細(xì)胞遷移[11]。與p21一樣,ERK3也是細(xì)胞有絲分裂過程中Cdk1的底物,其磷酸化受到Cdk1的調(diào)節(jié)[12]。ERK3促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移/侵襲和腫瘤的轉(zhuǎn)移,其表達(dá)在乳腺癌、肺癌、頭頸癌等多種癌癥中受到上調(diào)[13]。除ERK3外,p21的敲低還與MMP2表達(dá)減少有關(guān)。ERK3通過激活癌蛋白SRC3的磷酸化,引起包括MMP2在內(nèi)的不同MMP基因的上調(diào),從而在體外和體內(nèi)刺激肺癌細(xì)胞的侵襲。敲低ERK3則能夠抑制肺癌細(xì)胞的侵襲[14]。本研究的結(jié)果證實(shí),敲低p21后MMP2在mRNA和蛋白質(zhì)水平上也都表現(xiàn)出顯著的降低,進(jìn)一步證實(shí)了p21可能通過調(diào)控ERK3/MMP2信號路徑來影響滋養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)動能力。但到目前為止,關(guān)于ERK3與p21間的直接相關(guān)性的研究還十分缺乏。

綜上所述,本研究的結(jié)果表明p21與正常滋養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)動有關(guān),p21缺乏會減弱滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力。此外,p21缺乏還會降低ERK3和MMP2的表達(dá)。但與二者間的聯(lián)系到底是直接的還是間接的,目前還尚未可知,有待進(jìn)一步的研究。