后天繼發(fā)性免疫低下動(dòng)物模型研究及在中醫(yī)證候模型的應(yīng)用進(jìn)展

劉美怡錢(qián)深思容蓉楊勇?

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),濟(jì)南 250355;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心,濟(jì)南 250355)

免疫力是指機(jī)體在生存發(fā)展過(guò)程中所形成的識(shí)別“自我”與“非己”,并排斥“非己”而保護(hù)“自我”的能力,即機(jī)體自身的防御機(jī)制。免疫力低下包括因長(zhǎng)期生活作息不規(guī)律或某些原發(fā)疾病等所致的機(jī)體免疫功能下降,還包括老年人的免疫系統(tǒng)功能性衰退而表現(xiàn)出的免疫低下?tīng)顟B(tài)。當(dāng)免疫機(jī)能下降,機(jī)體容易處于亞健康狀態(tài),更容易受到致病因子的侵襲,因此,建立能反映免疫低下特點(diǎn)并可重復(fù)、穩(wěn)定的動(dòng)物模型將對(duì)開(kāi)展相關(guān)疾病的防控具有十分重要意義。本綜述主要介紹免疫低下模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、建模方法、評(píng)價(jià)指標(biāo)及其在中醫(yī)證候模型中的應(yīng)用,為今后選擇合適的免疫低下動(dòng)物模型開(kāi)展疾病發(fā)病機(jī)制、藥物評(píng)價(jià)等研究提供參考。

1 免疫低下動(dòng)物模型分類(lèi)

免疫低下模型動(dòng)物按照獲得方式不同可分為先天性免疫低下和后天繼發(fā)性免疫低下,前者為先天遺傳性缺陷病所致,后者則主要是由惡性腫瘤、病毒、藥物、營(yíng)養(yǎng)不良等所致。

1.1 先天性免疫低下動(dòng)物模型

先天遺傳性免疫損傷常見(jiàn)于以下模型:BALB/c-nu、C3H-nu、C57BL/6-nu、NIH-nu品系裸鼠以及La-sat品系等,是先天缺失一種或兩種免疫器官的模型動(dòng)物;CBA/N、Beige、SCID及B-NSG品系等,是各類(lèi)免疫細(xì)胞存在缺陷的小鼠模型;裸大鼠;SHR品系大鼠;還有C8αt-r缺損癥、C4缺損癥、C5缺損癥及C6缺損癥等補(bǔ)體缺損的免疫功能障礙動(dòng)物模型[1]。這些模型動(dòng)物普遍個(gè)體差異小,動(dòng)物用量少,且由于多是基因改變,免疫學(xué)特性比較穩(wěn)定,免疫缺陷維持時(shí)間較長(zhǎng);但缺點(diǎn)是由于先天免疫低下,有些品系小鼠生命周期僅維持在8.5個(gè)月左右,不利于長(zhǎng)期跟蹤實(shí)驗(yàn),繁殖力差,且價(jià)格大多昂貴,不利于廣泛開(kāi)展使用。

1.2 后天繼發(fā)性免疫低下動(dòng)物模型

模型建立多用小鼠、大鼠、家兔、雪貂、比格犬等動(dòng)物。目前常采用物理、化學(xué)及輻射的方法建立免疫低下動(dòng)物模型,雖然此法造成的免疫損傷是暫時(shí)的,但在可獲得性和經(jīng)濟(jì)性上,比先天免疫缺陷動(dòng)物模型更具可操作性?xún)?yōu)勢(shì),本文將對(duì)此進(jìn)行重點(diǎn)闡述。

2 后天繼發(fā)性免疫低下動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)

2.1 強(qiáng)電刺激法

電刺激法多選用大鼠,給予10 min的足底電擊刺激(電流強(qiáng)度1.0 mA,共33次,時(shí)間間隔為15 s,每次持續(xù)3 s),進(jìn)行為期14 d的造模。足底電擊可使其免疫受到抑制,IgG抗體水平降低[2]。此方法危險(xiǎn)系數(shù)較高且不易操作,因此,現(xiàn)少有研究采用強(qiáng)電刺激法建立免疫低下動(dòng)物模型。

2.2 輻射法

此法多采取3-6 Gy劑量的射線(xiàn)全身均勻照射小鼠或大鼠24 h來(lái)實(shí)現(xiàn),應(yīng)用最多的是60Co-γ射線(xiàn)和X射線(xiàn)。楊芳等[3]提供的方法為:40 cm×40 cm的照射視野,5 Gy劑量的X射線(xiàn)進(jìn)行一次性全身照射,源皮距為100 cm。輻射法所致免疫低下模型多表現(xiàn)為體重下降、活動(dòng)減少,脾和胸腺萎縮,T淋巴細(xì)胞亞群值改變[4],白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少等[5]。張蓉等[6]認(rèn)為輻射是一種毒邪,火熱熾盛易耗氣傷陰而氣血虧虛,現(xiàn)也有不少人采用輻射法制備動(dòng)物模型來(lái)研究中醫(yī)證候。郭平等[7]用60Co-γ射線(xiàn)建立血虛證小鼠模型,免疫學(xué)指標(biāo)降低的同時(shí),也出現(xiàn)了血虛證的表現(xiàn)。輻射法致免疫低下動(dòng)物模型多應(yīng)用于中醫(yī)藥抗輻射作用研究及保健食品對(duì)輻射損傷的輔助保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用研究。此法對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求較高,并且通過(guò)輻射法造模的動(dòng)物生命周期會(huì)縮短[8],不適用于周期較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 應(yīng)激法

應(yīng)激所致的肝郁脾虛可使正常免疫功能受阻,由此將應(yīng)激法用于構(gòu)建免疫低下模型。馬濤等[9]對(duì)Wistar大鼠施加束縛夾尾5 min、噪聲12 h、禁食禁水12 h等不可預(yù)見(jiàn)性刺激,進(jìn)行56 d實(shí)驗(yàn),通過(guò)慢性應(yīng)激建立肝郁脾虛抑郁模型,發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)了炎癥反應(yīng),細(xì)胞因子IL-1β含量增加,IFN-γ、IL-2等則減少,脾細(xì)胞免疫功能受損。黃曉峰等[10]每天從17:00-9:00將C57BL/6小鼠(6～8周齡,雌性)置于錐形管中束縛限制其活動(dòng),重復(fù)5 d,通過(guò)慢性心理應(yīng)激也能抑制免疫功能。

2.4 手術(shù)切除法

手術(shù)切除法是指通過(guò)切除免疫器官來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫低下,如脾切除模型的建立,方法如下:選擇6周齡雄性大鼠,麻醉備皮,沿左上腹旁正中進(jìn)腹剪開(kāi)1.5～2.0 cm大小的切口,結(jié)扎血管和脾蒂,摘除脾后縫合切口。術(shù)后免疫細(xì)胞活性減弱,CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均下降[11]。脾切除所致免疫低下?tīng)顟B(tài)維持時(shí)間較長(zhǎng),適用范圍較廣。

2.5 免疫抑制劑法

2.5.1 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)

CTX腹腔注射是常用的免疫低下動(dòng)物模型誘導(dǎo)方法。ICR小鼠、BALB/c小鼠、昆明小鼠、A/J小鼠、豚鼠和大鼠是常用的嚙齒類(lèi)模型動(dòng)物,此外還有家兔等哺乳類(lèi)動(dòng)物。CTX給藥劑量和時(shí)間是有效建立免疫低下模型重要的因素,文獻(xiàn)報(bào)道沒(méi)有統(tǒng)一的給藥劑量和時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)。相比較之下,小鼠模型多為80 mg/kg連續(xù)3 d和40 mg/kg連續(xù)10 d腹腔注射給藥。有學(xué)者對(duì)比研究不同劑量CTX對(duì)SD大鼠的造模效果,通過(guò)綜合存活率和白細(xì)胞計(jì)數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)得出:中劑量組(間隔3 d,第1天150 mg/kg,第4天100 mg/kg)是最佳的誘導(dǎo)劑量[12]。吳萌等[13]采用4個(gè)月兔齡的新西蘭大耳家兔,CTX劑量為28.75 mg/(kg·d),連續(xù)注射10 d,胸腺和脾指數(shù)明顯降低。

CTX建模后,動(dòng)物的體重、精神狀況和自主活動(dòng)量等表觀(guān)指標(biāo)可初步反映動(dòng)物的免疫功能狀況。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn),脾和胸腺指數(shù)降低、白細(xì)胞減少、IL-2、IL-4等細(xì)胞因子含量下降、IgG、IgM血清抗體水平下降、脾淋巴細(xì)胞增殖能力下降、巨噬細(xì)胞吞噬功能減弱、CD4+和CD8+及其比值均下降[14-15]。碳廓清實(shí)驗(yàn)是評(píng)估免疫水平的方法之一,尾靜脈注射墨水是碳廓清實(shí)驗(yàn)最常用的方式,王紅梅等[16]還推薦了內(nèi)眥靜脈注射墨水的方法。

近些年來(lái),CTX廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方和成分免疫調(diào)節(jié)作用研究的前期模型構(gòu)建,其引起的免疫抑制還可用于構(gòu)建中醫(yī)脾虛證[17]和血虛證[18]模型。

2.5.2 氫化可的松(hydrocortisone,HY)

HY可減弱免疫功能,SD大鼠或小鼠常作為此類(lèi)方法的模型動(dòng)物[19]。通常采用25 mg/(kg·d)的劑量,連續(xù)7 d皮下注射HY來(lái)建模。HY溶液一般現(xiàn)用現(xiàn)配,采用無(wú)水乙醇和生理鹽水(1∶5)溶解稀釋[20]。呂穎堅(jiān)等[21]證實(shí)造模后小鼠NK細(xì)胞活性降低、巨噬細(xì)胞吞噬能力減弱,整體免疫水平降低。血清IL-6、TNF-α、IFN-γ、小腸SIgA、IgG及補(bǔ)體C3的含量也可用于評(píng)價(jià)HY是否造模成功[20]。

錢(qián)宏梁等[22]配置0.0375 mg/mL濃度的HY水溶液于飲水瓶供小鼠飲用,連續(xù)14 d,建立虛證小鼠模型。研究認(rèn)為HY誘導(dǎo)的多是與脾、腎二臟有關(guān)的虛證[23-24],潘志強(qiáng)等[23]認(rèn)為HY用于構(gòu)建虛證動(dòng)物模型時(shí),較之其構(gòu)建免疫低下模型,應(yīng)稍減給藥劑量和延長(zhǎng)造模時(shí)間。

2.5.3 環(huán)孢素A(ciclosporin A,CsA)

CsA能有效抑制輔助性T淋巴細(xì)胞活性,抑制CD4+T細(xì)胞增殖,可用于構(gòu)建T細(xì)胞功能障礙免疫低下模型。夏琦等[25]采用0.2 mg/g劑量的CsA溶液,連續(xù)5 d腹腔注射,建立免疫低下小鼠模型。另有文獻(xiàn)報(bào)道了連續(xù)7 d注射30 mg/(kg·d)劑量CsA的可行方法[26]。由于艾滋病毒主要攻擊CD4+T細(xì)胞,所以環(huán)孢素A也用于免疫缺陷型動(dòng)物模型的建立,且研究表明中劑量25 mg/(kg·d)為造模最佳劑量[27]。此法一般采用小鼠作為模型動(dòng)物,灌胃、腹腔注射及肌內(nèi)注射這三種給藥途徑均能建立起免疫低下動(dòng)物模型[26]。

2.5.4 其他免疫抑制劑

國(guó)外學(xué)者采用醋酸可的松(100 mg/kg)對(duì)A/J小鼠連續(xù)3 d皮下注射的方法[28],以及地塞米松處理BALB/c小鼠的方法[29],都成功建立了免疫低下模型。也有比格犬模型的報(bào)道,通過(guò)連續(xù)7 d口服潑尼松龍(3.0 mg/kg)建立免疫低下模型[30]。另有研究者將雪貂設(shè)做研究對(duì)象,采用口服免疫抑制劑混合物(20 mg/kg霉酚酸酯,0.5 mg/kg他克莫司和8 mg/kg潑尼松龍)的方法建模[31-32]。由于雪貂呼吸道的受體分布和人類(lèi)十分相似,且會(huì)出現(xiàn)和人一樣的打噴嚏、流鼻涕等表現(xiàn),這些是其他模型動(dòng)物所不具備的特點(diǎn),被普遍認(rèn)為是研究流感病毒的優(yōu)良模型。

2.6 其他藥物方法

2.6.1 腺嘌呤

腺嘌呤可用于構(gòu)建腎虛且免疫低下大鼠模型,需提前用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液助懸,配置成1.5%的腺嘌呤混懸液,SD大鼠經(jīng)連續(xù)56 d灌胃腺嘌呤懸液(150 mg/kg)后,NK細(xì)胞活性降低、腎形態(tài)異常、補(bǔ)體C3水平下降,脾淋巴細(xì)胞也受到影響[33]。李卓恒等[34]通過(guò)腺嘌呤成功復(fù)制了腎虛大鼠模型,用于腎精虧虛證和腎虛生殖功能損傷的研究。免疫低下與中醫(yī)腎虛證相關(guān)聯(lián),因此可通過(guò)建立免疫低下動(dòng)物模型來(lái)研究中醫(yī)腎虛證,但腺嘌呤致腎虛證造模時(shí)間稍長(zhǎng)。

2.6.2 利血平

利血平最初用于中醫(yī)脾虛證、肝郁脾虛證的建模,但其會(huì)造成模型動(dòng)物腸道吸收功能受阻,蛋白質(zhì)合成不足,機(jī)體免疫功能下降,因此可用來(lái)構(gòu)建免疫低下模型?？赏ㄟ^(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)17 d的背部皮下注射利血平(10-4g/kg)來(lái)建模[35]。研究表明腹腔注射利血平(4 mg/kg)可成功建立大鼠抑郁模型,懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)等可作為評(píng)價(jià)造模是否成功的判斷依據(jù)。造模后,胸腺和脾指數(shù)下降,炎性因子IL-1β和TNF-α水平升高[36],利血平所致脾虛證可進(jìn)一步用于構(gòu)建免疫低下模型。

2.6.3 D-半乳糖(D-galactose,D-gal)

D-gal常作為致衰劑用于構(gòu)建衰老模型[37-38],但機(jī)體的衰老機(jī)制與免疫功能的變化息息相關(guān)[39],也有少數(shù)人采用D-gal致衰來(lái)間接構(gòu)建免疫低下模型。方法主要有兩種:小鼠采用125 mg/kg的劑量頸背部注射,連續(xù)45 d[40];大鼠采用350 mg/kg的劑量頸背部注射,連續(xù)42 d[41]。研究證實(shí)其可用于陽(yáng)虛證和衰老腎虛模型的制備[41-42]。此法造模周期較長(zhǎng),文獻(xiàn)報(bào)道在6～8周左右。

3 免疫低下動(dòng)物模型與中醫(yī)證候模型的關(guān)系

中醫(yī)證候模型是研究疾病發(fā)生發(fā)展及中醫(yī)藥作用機(jī)制的有效工具,是中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。中醫(yī)證候模型的建立無(wú)論是采用疾病模型、病因模型、病證結(jié)合模型等都與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的動(dòng)物模型評(píng)價(jià)緊密相關(guān)。已有研究證實(shí),肝郁證、脾虛證、肝郁脾虛證和腎陽(yáng)虛證候與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫低下有一定關(guān)系,都不同程度地抑制了機(jī)體免疫[43-46]?，F(xiàn)將免疫低下模型和中醫(yī)證候模型相關(guān)聯(lián),主要包括:腎虛證、肝郁脾虛證、血虛證等(表1,2)。

4 討論

目前國(guó)內(nèi)外建立免疫低下動(dòng)物模型的方法有很多,各有優(yōu)缺點(diǎn)。但無(wú)論采用何種方法建模,都很難保證實(shí)驗(yàn)中能同時(shí)抑制模型動(dòng)物的所有免疫學(xué)指標(biāo),僅能保證選擇合適的方法、藥物、劑量和時(shí)間點(diǎn),來(lái)影響模型動(dòng)物的部分免疫學(xué)指標(biāo)[48]。常用到的動(dòng)物有小鼠、大鼠、新西蘭大耳家兔及雪貂等,但實(shí)驗(yàn)選擇中最常見(jiàn)的還是小鼠,這與小鼠在可操作性和經(jīng)濟(jì)性上表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)有關(guān)。檢測(cè)指標(biāo)可包括:模型動(dòng)物的宏觀(guān)指標(biāo)(體重、攝食進(jìn)水量、自主活動(dòng)等)、臟器(胸腺、脾)指數(shù)、動(dòng)物存活率、血常規(guī)水平、各細(xì)胞因子含量與所占比例以及T淋巴細(xì)胞亞群值等。這些都是在免疫力低下模型研究中可借鑒和參考的方法。

表1 免疫低下模型與中醫(yī)證候模型的關(guān)聯(lián)Table 1 Correlation between immunocompromised models and traditional Chinese medicine syndrome models

表2 免疫低下模型在中醫(yī)證候中的應(yīng)用Table 2 Application of immunocompromised models in traditional Chinese medicine syndrome models

中醫(yī)藥具有整合調(diào)節(jié)、扶正祛邪的作用,其多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的綜合治療能夠較好地改善機(jī)體亞健康狀態(tài),中醫(yī)藥在治療免疫力低下這類(lèi)疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?！懊庖吡Φ拖隆彪m然是西醫(yī)的病名,應(yīng)用到中醫(yī)、中藥的現(xiàn)代研究就必然要涉及到中醫(yī)證候的定位及病證結(jié)合模型的研究。我們認(rèn)為可以在以下兩個(gè)方面找到結(jié)合點(diǎn):一是借鑒中醫(yī)證候的造模方法,再結(jié)合免疫低下造模的手段,綜合評(píng)價(jià)復(fù)合模型的中醫(yī)證候指標(biāo)及微觀(guān)免疫學(xué)指標(biāo);另一方面是以現(xiàn)有的免疫低下造模方法為主體,擴(kuò)展中醫(yī)證候的評(píng)價(jià)指標(biāo),以已有成熟的某種免疫低下造模方法來(lái)模擬某類(lèi)中醫(yī)證候模型的評(píng)價(jià)模式。這種病證結(jié)合模型研究將遵循中醫(yī)理論指導(dǎo)的基本原則,既符合傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)體系,又能結(jié)合現(xiàn)代免疫學(xué)進(jìn)展的技術(shù)和方法,深入探討中醫(yī)藥“扶正祛邪”、“正氣存內(nèi),邪不可干”等普適性治則治法的作用機(jī)理及藥物干預(yù)機(jī)制,將能極大地推動(dòng)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究進(jìn)程。因此,我們認(rèn)為已有免疫低下動(dòng)物模型的再評(píng)價(jià)、免疫力低下復(fù)合證候模型的研究模式將是今后此類(lèi)動(dòng)物模型在中醫(yī)藥領(lǐng)域開(kāi)展研究的一個(gè)重要方向。