不同因素對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌肥大模型建立影響的比較研究

劉景艷,朱亮,蔡月琴,張利棕,富丹婷,蔡兆偉,王德軍

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所,杭州 310053)

心血管疾病死亡率居于疾病死亡構(gòu)成的首位,是威脅我國居民健康的頭號(hào)殺手[1]。心肌肥大(cardiac hypertrophy,CH)是多種心血管疾病共有的病理特征,指心臟應(yīng)對(duì)持續(xù)增加的心臟負(fù)荷的一種適應(yīng)性代償反應(yīng),主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、心臟重量增加、間質(zhì)細(xì)胞增生以及心肌重構(gòu)等[2]。當(dāng)長期負(fù)荷過重時(shí),心臟會(huì)失代償,心臟收縮功能衰退最終會(huì)導(dǎo)致心力衰竭,增加猝死發(fā)生率。雖然心肌肥大是最終導(dǎo)致心衰和死亡的主要原因,但由于其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,迄今沒有有效防治心肌肥大的方法。因此,深入探討影響心肌肥大發(fā)病的因素及其機(jī)制對(duì)防治心衰等心血管疾病顯得極為重要。

建立穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型是深入研究心肌肥大發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)是一種構(gòu)建心肌肥大模型的常用藥物,可導(dǎo)致大鼠心肌損傷壞死、纖維化及心室重構(gòu),同時(shí)伴隨著心臟功能下降,表現(xiàn)出許多與人類心肌肥大相似的代謝和形態(tài)學(xué)異常[3-5]。目前皮下注射ISO誘導(dǎo)建立心肌肥大動(dòng)物模型相關(guān)的研究較多,但使用的注射劑量差別很大,1～10 mg/kg范圍均有報(bào)道。劑量過高或低對(duì)模型影響如何、動(dòng)物存活率或死亡率之間是否有差異并不是十分清楚,缺乏客觀有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外,性別差異是近年來心血管疾病研究中容易忽視的科研盲點(diǎn),并且也是導(dǎo)致很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以重復(fù)的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn),在容量負(fù)荷性大鼠和壓力負(fù)荷性小鼠模型中,雌鼠多發(fā)生向心性肥大而雄鼠傾向于離心性肥大,并且雌鼠具有更高的室壁厚度[6-7]。Fliegner等[8]在慢性壓力負(fù)荷引起的CH小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),雄性小鼠相比雌鼠具有更多的心肌纖維化和凋亡。這些研究表明,注射劑量或性別不同對(duì)動(dòng)物心肌肥大模型的建立都有顯著影響,但I(xiàn)SO注射劑量高低對(duì)不同性別大鼠心肌肥大模型建立的影響如何卻仍未見報(bào)道。

本項(xiàng)目采用不同劑量ISO進(jìn)行頸背部皮下注射,建立雌性和雄性SD大鼠心肌肥大模型,觀測(cè)超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)、心臟指數(shù)及組織病理學(xué)指標(biāo)以及肥大基因(ANP、BNP)mRNA表達(dá)水平的改變,通過比較不同性別和注射劑量因素對(duì)大鼠心肌肥大模型建立影響的差異,為探索和優(yōu)化大鼠心肌肥大模型的建立方法以及進(jìn)一步研究心肌肥大的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性和雌性SD大鼠56只,6～8周齡,體重200～220 g,由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心/上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供【SCXK(滬)2017-0005】。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心【SYXK(浙)2018-0012】,環(huán)境溫度(22±2)℃,相對(duì)濕度50%～60%,光照:12 h/12 h明暗交替,噪聲<50 dB;在IVC籠內(nèi)飼養(yǎng),自由飲食。所有實(shí)驗(yàn)步驟均按照中國關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和護(hù)理的立法進(jìn)行,并經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物福利與倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):IACUC-20190826-09)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

異氟烷(江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司,20190801),烏拉坦(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20130609),ISO(SIGMA公司,I5627-5G)Masson三色染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司,20181026),蘇木色精(上海伯奧生物科技有限公司,180701),曙紅Y(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,20171112),DEPC處理水(生工生物工程(上海)股份有限公司,E625BA0016),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司,RR036A),熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司,RR820A)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Vevo2100小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(Visual Sonics,加拿大);ALC-NIBP(8道)無創(chuàng)血壓測(cè)定系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司,中國);ASP200S封閉式組織脫水機(jī)(Microm,德國);包埋機(jī)(Microm,德國);半自動(dòng)石蠟切片機(jī)(Microm,德國);自動(dòng)染色機(jī)(Microm,德國);數(shù)字病理切片(熒光)掃描分析儀(VS120-S6-W,Olympus,日本);iQ5型RT-PCR儀和PTC-200型PCR儀(美國BIO-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

SD大鼠分為6組:雄性正常組(M C組,n=6)、雄性1.25 mg/kg(M 1.25 mg/kg組,n=11)、雄性5 mg/kg(M 5 mg/kg組,n=11),雌性正常組(F C組,n=6)、雌性1.25 mg/kg(F 1.25 mg/kg,n=11)、雌性5 mg/kg(F 5 mg/kg,n=11)模型組頸背部皮下注射ISO,正常組注射等量生理鹽水,ISO干粉用生理鹽水配置(2.5 mg/mL),連續(xù)注射10 d,期間大鼠自由飲食。每組隨機(jī)選取仍存活大鼠各6只,進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 大鼠的一般情況觀察

每天觀察記錄大鼠體重,注射ISO后飲食,活動(dòng),毛色,糞便,死亡等情況。

1.2.3 心臟重量參數(shù)測(cè)定

檢測(cè)結(jié)束后,處死動(dòng)物并迅速剖開胸腔取出心臟,剪去心房及周圍結(jié)締組織后用預(yù)冷的生理鹽水沖洗心臟后用濾紙吸干,肉眼觀察心臟大小并拍照,稱重,電子天平準(zhǔn)確稱量全心重量(heart weight,HW),去除游離右心室后,稱取左心室的重量(left ventricular weight,LVW),計(jì)算游離右心室重量(right ventricular weight,RVW)、全心重量/體重的比值(HW/BW)、左心室重量/體重的比值(LVW/BW)、游離右心室重量/體重的比值(RVW/BW)。

1.2.4 大鼠超聲心動(dòng)圖測(cè)定

用高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng),在二尖瓣腱索水平記錄M型超聲心動(dòng)圖,分別測(cè)量左室舒張末期室間隔厚度(left ventricular end-diastolic interventricular septal thickness,IVSd)、左室收縮末期室間隔厚度(left ventricular end-systolic interventricular septal thickness,IVSs)、左室后壁舒張末期厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness,LVPWd)、左室后壁收縮末期厚度(left ventricular end-systolic posterior wall thickness,LVPWs)連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的指標(biāo)并取平均值。

1.2.5 大鼠心肌組織ANP和BNP基因mRNA表達(dá)水平

TRIzol法提取大鼠心肌組織總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script TM RT reagent逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用表1列出的引物將cDNA用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行Real time PCR擴(kuò)增,所有反應(yīng)信息資料由ABI StepOnePlus PCR儀收集,以GAPDH基因作為內(nèi)參基因,采用2-△△CT法計(jì)算各組大鼠心肌組織ANP和BNP基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.2.6 大鼠血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定

20%烏拉坦麻醉大鼠(5 mg/kg),自頸中線切開皮膚,將微型導(dǎo)管經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入直至左心室。穩(wěn)定5 min后,測(cè)量大鼠心率(heart rate,HR)、左室收縮末壓(left ventricular end-systolicpressure,LVESP)、左室舒張末壓(left ventricular enddiastolicpressure,LVEDP)、左心室最大收縮速率(left ventricular pressure maximal rate of rise,dp/dtmax)、左心室最大舒張速率(left ventricular pressure maximal rate of fall,-dp/dtmax)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。

1.2.7 大鼠心臟病理學(xué)觀察

取心臟非心尖部分進(jìn)行常規(guī)H&E和Masson染色后于光學(xué)顯微鏡下行心臟組織病理學(xué)觀察。測(cè)量室間隔側(cè)心內(nèi)膜下層心肌細(xì)胞面積(選取近圓形細(xì)胞40個(gè))、纖維化程度(計(jì)算纖維化區(qū)域10個(gè)鏡頭下的纖維化程度),取其平均值作為應(yīng)測(cè)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖片使用GraphPad Prism 8和Image-Pro Plus 6軟件處理,結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用One-way ANOVA方差分析,存活率采用log-rank檢驗(yàn),P<0.05表明差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),皮下注射ISO后,大鼠出現(xiàn)氣喘,活動(dòng)減少,飲水量增加,呼吸加快,口、鼻處有血性分泌物,猝死一般發(fā)生在注射ISO后15～35 min內(nèi),解剖可見肺部明顯水腫和出血。由圖1可見,正常組無死亡情況,雄性低、高劑量組存活率分別為63.6%、81.8%,雌性低、高劑量存活率分別為63.6%、55.0%。結(jié)果表明,雄性大鼠高劑量組存活率高,而雌性大鼠低劑量組存活率高,但各ISO處理組存活率之間無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 ISO對(duì)大鼠存活率的影響(±s,n=6)Figure 1 Effect of ISO on rat survival rate(±s,n=6)

2.2 大鼠心肌肥大情況

由圖2可見,各正常組大鼠心臟形態(tài)、大小無異常,而ISO處理組心臟體積均有不同程度的增大,且心尖外觀局部可見灰白色。無論性別如何,兩種劑量模型組大鼠HW/BW、LVW/BW、RVW/BW均顯著高于正常組(P<0.01);雄性高劑量組大鼠HW/BW和LVW/BW值顯著高于低劑量組(P<0.01),雌性大鼠高、低劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。比較性別之間差異時(shí),高劑量雄性大鼠LVW/BW值顯著高于相同劑量雌性大鼠(P<0.01),而低劑量組雌雄大鼠之間無顯著差異(P>0.05)。所以,劑量因素對(duì)雄性大鼠HW/BW、LVW/BW的影響呈劑量依賴關(guān)系,對(duì)雌性大鼠影響較小。

圖2 大鼠心臟形態(tài)及重量參數(shù)(±s,n=6)Note.Compared with male normal group,??P<0.01;Compared with female normal group,##P<0.01;vv P<0.01.(The same in the following Figures)Figure 2 Rat heart morphology and weight parameters(±s,n=6)

2.3 大鼠心臟超聲指標(biāo)變化

不同性別和劑量因素對(duì)大鼠心臟超聲指標(biāo)的影響見圖3。雄性高劑量組心室壁(IVSd、IVSs、LVPWd)顯著高于正常組(P<0.01),但雄性低劑量組心室壁厚度無顯著變化(P<0.05)。雌性各劑量組心室壁(IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs)均顯著高于正常組(P<0.01,P<0.05)。無論性別如何,上述指標(biāo)在不同劑量之間均無顯著性差異(P>0.05)。比較性別之間差異時(shí),相同劑量下雌、雄大鼠心室壁厚度無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 ISO對(duì)大鼠左心室壁厚度的影響(±s,n=6)Figure 3 Effect of ISO on the left ventricular wall thickness in rats(±s,n=6)

2.4 大鼠心肌組織肥大基因ANP、BNP mRNA表達(dá)水平變化

如圖4所示,無論性別如何,兩種劑量模型組動(dòng)物心肌組織ANP、BNP基因mRNA表達(dá)水平均顯著高于各正常組(P<0.05,P<0.01),且雄性高劑量組ANP基因mRNA表達(dá)水平顯著高于雄性低劑量組和雌性高劑量組(P<0.01),但雌性各劑量組之間ANP、BNP基因mRNA表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.01)。

圖4 大鼠心肌組織ANP、BNP mRNA表達(dá)水平變化(±s,n=6)Figure 4 Changes of mRNA expression levels of ANP and BNP in myocardial tissue of rats(±s,n=6)

2.5 大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化

由圖5可知,雄性高劑量組動(dòng)物HR、LVESP(P<0.05)、LVEDP、dp/dpmax、-dp/dpmax絕對(duì)值顯著低于正常組動(dòng)物(P<0.01),而低劑量組LVESP卻顯著增加(P<0.01),且雄性高劑量組LVESP、-dp/dpmax絕對(duì)值也顯著低于低劑量組(P<0.01)。雌性高、低劑量組動(dòng)物HR、LVESP、LVEDP、dp/dpmax、-dp/dpmax絕對(duì)值均顯著性低于正常組動(dòng)物(P<0.01),且低劑量組LVEDP、dp/dpmax絕對(duì)值顯著低于高劑量組(P<0.01)。比較同一劑量下性別差異時(shí)發(fā)現(xiàn),雄性低劑量動(dòng)物L(fēng)VESP、-dp/dpmax絕對(duì)值顯著高于雌性低劑量組動(dòng)物(P<0.01),但高劑量下雌、雄動(dòng)物之間無顯著性差異。

圖5 大鼠左心室心功能指標(biāo)變化(±s,n=6)Figure 5 Changes of left ventricular function indexes in rats(±s,n=6)

2.6 大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2.6.1 心肌組織H&E染色結(jié)果

H&E染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),雌、雄正常組心肌細(xì)胞排列整齊,間隙清晰,細(xì)胞核橢圓且位于細(xì)胞正中;各ISO處理組心肌細(xì)胞均排列紊亂,間隙增寬,心肌細(xì)胞面積增大,細(xì)胞核變形;左心室心內(nèi)膜下層局部組織有散在小灶性及條索狀壞死,心肌細(xì)胞水腫,有大量炎癥細(xì)胞浸潤及膠原纖維增生,局灶性壞死病理改變明顯(圖6)。

圖6 大鼠心肌組織H&E染色Figure 6 H&E staining of rat myocardial tissue

2.6.2 心肌組織Masson染色結(jié)果

圖7結(jié)果顯示,與各正常組相比,ISO處理組左心室心內(nèi)膜下層局部組織有大量膠原纖維增生,心肌纖維染色陽性區(qū)域增多,在內(nèi)皮下區(qū)域的肌內(nèi)膜中有大量的條索狀及斑片狀纖維組織沉積,且室間隔側(cè)心肌細(xì)胞橫截面積和心肌組織纖維化程度均顯著增大(P<0.01)。同性別高、低劑量比較和同劑量不同性別比較時(shí),大鼠室間隔側(cè)心肌細(xì)胞肥大和纖維化程度均無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活在心肌肥厚的形成機(jī)制中扮演重要角色[9-10]。已有許多研究證實(shí),高腎上腺素活性與心肌肥厚的發(fā)生相關(guān)[11-12]。ISO是一種非選擇性β-腎上腺素受體激動(dòng)劑,其誘發(fā)心室重構(gòu)的作用得到研究者廣泛認(rèn)可和應(yīng)用,采用此法誘導(dǎo)心肌肥大操作簡單、模型穩(wěn)定、成本低,已成為大鼠心肌肥大動(dòng)物模型造模的常用方案之一。但該造模方法存在注射劑量、部位以及誘導(dǎo)時(shí)間不統(tǒng)一以至難以復(fù)制或評(píng)價(jià)的缺點(diǎn)。不僅如此,人和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均已證實(shí),心肌肥大發(fā)生存在明顯的性別差異[13-14]。為探討不同劑量以及性別因素對(duì)大鼠心肌肥大模型建立的影響,本研究通過采用皮下注射不同劑量ISO(5 mg/kg和1.25 mg/kg)的方法同時(shí)誘導(dǎo)建立雌性和雄性SD大鼠心肌肥大模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種劑量ISO處理后,雌、雄大鼠心臟均呈現(xiàn)不同程度的病理性肥大,但雄性大鼠多個(gè)心肌肥大指標(biāo)變化呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系,并且高劑量組雄性大鼠存活率高些。雌性大鼠心肌肥大指標(biāo)變化對(duì)劑量依賴關(guān)系不如雄性,并且低劑量組雌性大鼠存活率高于高劑量組。

目前有關(guān)多因素影響動(dòng)物心肌肥大模型建立的報(bào)道較少。王曉燕等[15]研究了ISO注射劑量和時(shí)間對(duì)雄性Wistar大鼠心力衰竭模型的影響,發(fā)現(xiàn)高劑量ISO(10 mg/kg)注射對(duì)大鼠心臟功能損傷指標(biāo)和存活率影響優(yōu)于中、低劑量(5 mg/kg和2.5 mg/kg)。雖然結(jié)果和本研究中劑量因素對(duì)雄性大鼠的影響有相似的地方,但不同之處是他們只研究了單一性別的雄性大鼠,并且ISO處理時(shí)間不一樣,主要是因?yàn)樗麄冄芯康氖切牧λソ叨切募》蚀竽Ｐ?。最?朱竟赫等[16]也采用皮下注射不同劑量ISO的方法建立雄性小鼠慢性心肌缺血模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量ISO(32 mg/kg)注射對(duì)小鼠心肌缺血指標(biāo)的影響優(yōu)于中、低劑量(16 mg/kg和8 mg/kg),并且死亡率低,這和我們的部分結(jié)果部分一致。

我們的結(jié)果還發(fā)現(xiàn),不同劑量條件下ISO誘發(fā)的雌性和雄性大鼠心肌肥大發(fā)病存在明顯差異。例如,高劑量組雌性大鼠LVW/BW、LVESP和ANP mRAN表達(dá)水平低于同劑量雄性大鼠,這種差異在低劑量時(shí)較小。有關(guān)大、小鼠心肌肥大模型性別差異的研究前期已有報(bào)道。例如,在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的SD大鼠心肌肥大模型中,雌鼠具有更高的心室壁厚度和心肌細(xì)胞直徑,但心肌纖維化程度卻低于雄鼠[17]。但在自發(fā)性高血壓SHR大鼠模型中,雄鼠比雌鼠具有更嚴(yán)重的左心室肥大以及心肌纖維化[18]。不僅如此,皮下注射ISO(10 mg/kg)引起的心臟重塑在不同性別小鼠間也存在差異,雌性小鼠心室壁厚度、心肌面積和膠原蛋白沉積增加的程度小于雄性小鼠,但血壓、心率和心功能指標(biāo)之間性別差異不大[19]。上述研究結(jié)果表明,性別因素對(duì)大、小鼠心肌肥大模型都有重要影響,不過這些研究和本文發(fā)現(xiàn)的高劑量時(shí)雄性大鼠左心室相對(duì)重量顯著高于雌性大鼠,但心肌細(xì)胞面積和纖維化程度之間沒有明顯差異的結(jié)果不太一致,導(dǎo)致這種差異的原因比較復(fù)雜,可能和造模方法、時(shí)間以及品種、品系不同有關(guān)。

圖7 大鼠心肌組織Masson染色Note.A,Masson staining of rat myocardial tissue.B,Partially enlarged view of Figure A at the arrow.Figure 7 Masson staining of rat myocardial tissue

綜上所述,本研究通過比較不同劑量和性別因素對(duì)ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌肥大模型建立的影響,發(fā)現(xiàn)ISO注射劑量高低對(duì)雄性大鼠心肌肥大程度影響較大,并且雄性大鼠高劑量組存活率高于低劑量組。雖然劑量因素對(duì)雌性大鼠模型肥大程度影響不明顯,但雌性低劑量組存活率較高。所以在進(jìn)行ISO誘導(dǎo)建立大鼠心肌肥大模型時(shí),可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和動(dòng)物性別預(yù)期選擇性的采用兩個(gè)不同注射劑量。