龍小平，唐艷華，李建民，王衛(wèi)忠，歐大明，許麗慧，何菁子，謝立虎

1南華大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，湖南衡陽421001 2湖南省人民醫(yī)院呼吸重癥醫(yī)學科，長沙410005 3南華大學附屬第一醫(yī)院風濕免疫科，湖南衡陽421001

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)和特發(fā)性非特異性間質(zhì)性肺炎(idiopathic nonspecific interstitial pneumonia，iNSIP)都屬于原因不明的間質(zhì)性肺炎。吡非尼酮是兼具抗纖維化、抗炎和抗氧化作用的藥物[1- 5]，研究顯示其治療IPF的效果令人鼓舞[6-7]，但在iNSIP中的研究甚少。本研究評估并比較了吡非尼酮對iNSIP和IPF患者肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages，AMs)產(chǎn)生的炎癥細胞因子/趨化因子的影響。

對象和方法

對象2015年1月至2018年12月在南華大學附屬第一醫(yī)院確診的10例iNSIP患者和11例IPF患者，所有患者基本臨床癥狀、肺部高分辨率CT(high-resolution computed tomography，HRCT)和/或組織病理學表現(xiàn)均符合2015年美國胸科學會(American Thoracic Society，ATS)/歐洲呼吸學會(European Respiratory Society，ERS)診斷標準[8]。選擇同期具有正常肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細胞分類且沒有任何間質(zhì)性肺疾病(non-interstitial lung disease，non-ILD)的8例患者作為對照。本研究經(jīng)南華大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均已簽署知情同意書。

肺功能檢測測量指標包括：用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、1秒鐘用力呼氣量(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、肺總能力(total lung capacity，TLC)、肺部一氧化碳擴散能力(diffusing capacity of the lung for carbon monoxide，DLco)、動脈血氧分壓(partial pressure of oxygen in arterial blood，PaO2)，以及與血液樣品采集一起進行肺泡-動脈氧梯度(alveolar arterial oxygen gradient，AaDO2)。數(shù)值表示為預測值占正常值的百分比。

BALF細胞采集將總體積為200 ml的生理鹽水均等分成10份，每份20 ml，依次灌注到右肺中葉，隨后立即抽吸回收BALF。將回收的BALF通過兩層無菌紗布過濾放置于聚乙烯試管中，于4℃下以500×g離心10 min，倒去上清液，將細胞沉淀用磷酸鹽緩沖鹽水溶液洗滌3次。常規(guī)測定細胞總數(shù)、細胞分類和淋巴細胞亞型。細胞存活率采用胎盤藍染色測定。

AMs培養(yǎng)BALF細胞洗滌3次后，加用10%RPMI 1640溶液(10%滅活的小牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、200 U/ml青霉素和200 mcg/ml鏈霉素)(Seromed；Biochrom KG；Berlin，Germany)，將細胞沉淀混勻成為1.0×106/ml密度的細胞懸浮液，隨后分加至24孔塑料組織培養(yǎng)平板中(Falcon，Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)，放置于含5%CO2的增濕培養(yǎng)箱中37.0℃溫育1 h，使巨噬細胞充分附壁。再采用2%RPMI 1640溶液洗滌3次去除沒有附壁的細胞，在黏附有AMs的每個培養(yǎng)孔里加1 ml 10% RPMI 1640溶液，放置于含5%CO2的增濕培養(yǎng)箱中37℃溫育24 h，其中，1組添加100 ng脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)；在不含和含100 ng/ml LPS的兩種條件下，分別給予濃度為0.03、 0.10和0.30 mg/ml吡非尼酮(Shionogi &Co.，Ltd.，Osaka，Japan)處理(預實驗中，AMs培養(yǎng)24 h后，使用胎盤藍染色測定AMs細胞活性，不同濃度的吡非尼酮對AMs細胞活性均無影響)。溫育結(jié)束時，吸取培養(yǎng)上清液保存至小試管中，離心去除底層細胞，保留細胞培養(yǎng)上清液，-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

細胞因子/趨化因子的測定采用基于熒光珠的多重技術Luminex(Bio-Rad BioPlex200；Bio-Rad Laboratories，Munich，Germany)測定培養(yǎng)的上清液中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、可溶性TNF受體(soluble TNF receptor，TNFR)- 1、sTNFR- 2、白細胞介素(interleukin，IL)- 1β、IL- 8、IL- 10、單核-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、IL- 18、巨噬細胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)- 1β、干擾素誘導單核因子(interferon-gama inducible monokines，MIG)/趨化因子(C-X-C motif ligand 9，CXCL)- 9和干擾素誘導蛋白- 10(interferon-gama inducible protein 10，IP- 10)/CXCL10。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一般情況所有患者在接受BALF時均未接受皮質(zhì)類固醇、免疫抑制和/或抗纖維化治療。2例iNSIP患者(20%)和3例IPF患者(27%)接受經(jīng)纖維支氣管鏡冷凍肺活檢。iNSIP、IPF和對照組在年齡(F=0.687，P=0.568)、性別(F=0.642，P=0.452)和吸煙狀況(F=0.587，P=0.872)方面差異均無統(tǒng)計學意義。iNSIP和IPF組患者的FVC%(P=0.017和P=0.005)、TLC%(P=0.001和P=0.002)和DLco%(P<0.001和P<0.001)均顯著低于對照組；BALF中巨噬細胞(P=0.003和P=0.004)顯著低于對照組，淋巴細胞(P=0.014和P=0.025)、中性粒細胞(P=0.035和P=0.046)及嗜酸性粒細胞(P=0.001和P=0.032)均顯著高于對照組。iNSIP組患者的巨噬細胞明顯低于IPF組(P=0.015)，淋巴細胞明顯高于IPF組(P=0.042)(表1)。

表1 3組患者基本情況比較

基礎狀態(tài)AMs釋放細胞因子/趨化因子iNSIP和IPF組患者AMs產(chǎn)生的TNF-α(P<0.001和P<0.001)、sTNFR- 1(P=0.022和P=0.015)、sTNFR- 2(P=0.005和P=0.009)、IL- 1β(P=0.042和P=0.047)、IL- 10(P=0.024和P=0.035)、GM-CSF(P=0.035和P=0.042)、MIP- 1β(P=0.036和P=0.042)、MIG(P<0.001和P=0.024)和IP- 10濃度(P<0.001和P=0.018)均顯著高于對照組，iNSIP組患者AMs產(chǎn)生的MIG(P=0.004)和IP- 10濃度(P<0.001)顯著高于IPF組，3組患者AMs產(chǎn)生的IL- 18濃度差異無統(tǒng)計學意義(F=0.562，P=0.756)(表2)。

表2 基礎狀態(tài)iNSIP、IPF和對照組患者BALF中AMs釋放的細胞因子/趨化因子比較

LPS刺激AMs釋放細胞因子/趨化因子加用LPS刺激后，iNSIP和IPF組患者AMs產(chǎn)生的TNF-α(P<0.001和P=0.008)、sTNFR- 1(P=0.007和P=0.006)、sTNFR- 2(P<0.001和P<0.001)、IL- 1β(P<0.001和P<0.001)、IL- 10(P=0.043和P=0.035)、GM-CSF(P<0.001和P<0.001)、MIP- 1β(P<0.001和P<0.001)、MIG(P<0.001和P=0.025)和IP- 10濃度(P<0.001和P=0.004)均顯著高于對照組，IL- 18(P=0.035和P=0.041)均顯著低于對照組；iNSIP組患者AMs產(chǎn)生的MIG(P<0.001)和IP- 10濃度(P<0.001)顯著高于IPF組，LPS不能促進MIG的釋放(表3)。

吡非尼酮對AMs細胞因子/趨化因子釋放的影響在有和沒有LPS刺激的情況下，吡非尼酮可劑量依賴性降低iNSIP組和IPF組患者AMs釋放的TNF-α、sTNFR- 1、sTNFR- 2、IL- 1β、IL- 10、GM-CSF、IL- 18、MIP- 1β、MIG和IP- 10表達水平，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)(表4、5)。

表3 LPS刺激下iNSIP、IPF和對照組患者BALF中AMs釋放的細胞因子/趨化因子比較

表4 吡非尼酮抑制iNSIP和IPF患者BALF中AMs自發(fā)釋放的細胞因子/趨化因子效果比較

表5 吡非尼酮抑制iNSIP和IPF患者BALF中AMs在LPS刺激下釋放的細胞因子/趨化因子效果比較

討 論

本研究結(jié)果顯示，iNSIP和IPF患者BALF中的AMs在體外實驗中能產(chǎn)生Th1型細胞因子、Th2型細胞因子、促血管形成趨化因子和抗血管形成趨化因子，均顯著高于對照組(IL- 18除外)，與以往關于iNSIP和IPF患者研究報道結(jié)果類似[9]，意味著AMs在編排間質(zhì)性肺炎(interstitial lung diseases，ILDs)細胞因子/趨化因子網(wǎng)絡中起關鍵作用[10-11]。吡非尼酮能有效抑制上述細胞因子/趨化因子的釋放，這種抑制作用在LPS刺激后更為突出，可能與調(diào)節(jié)caveolin- 1蛋白表達及NLRP3炎性小體激活相關[12-13]。

以往研究表明，iNSIP和IPF中的AMs自發(fā)釋放高水平的TNF-α、sTNFR- 1、sTNFR- 2、IL- 1β、IL- 10、GM-CSF、MIP- 1β、MIG和IP- 10，而吡非尼酮在0.30 mg/ml時能有效抑制上述細胞因子/趨化因子釋放，這些細胞因子/趨化因子在肺部炎癥和纖維化病變中扮演著非常重要的角色[11，14]，與本研究結(jié)果一致。與TNF-α相比，IL- 1是中性粒細胞積聚和細胞因子產(chǎn)生的更強啟動子[15]，IL- 1β可以模擬博來霉素的作用并誘導小鼠肺纖維化[13，16]。本研究結(jié)果顯示，吡非尼酮可以顯著抑制iNSIP和IPF患者BALF中AMs的IL- 1β釋放。TNFR通過蛋白水解切割產(chǎn)生sTNFR，并且它們被認為是TNF-α抑制劑，其可以通過競爭性結(jié)合中和TNF-α誘導的細胞毒性和免疫活性[17]。目前已在多種肺部疾病的BALF中觀察到sTNFR- 1和sTNFR- 2上調(diào)，AMs可能是sTNFR- 2的主要來源，但AMs可能不是肺泡腔中sTNFR- 1的主要來源[9]。在單核細胞/巨噬細胞中，每種可溶性受體的釋放通過不同的機制調(diào)節(jié)，并且sTNFR- 2似乎更容易在LPS、IFN-γ、IL- 1和TNF-α等炎性刺激下大量釋放[12]，這可以解釋本研究中iNSIP、IPF和對照組患者AMs在LPS刺激下細胞培養(yǎng)上清液中檢測到sTNFR- 2顯著高于sTNFR- 1的原因。

Th- 1和Th- 2細胞因子網(wǎng)絡之間存在不平衡，過量的Th- 2細胞因子與肺纖維化的發(fā)展有關。IL- 10是Th- 2家族的T細胞衍生細胞因子，具有抗纖維化和促纖維化活性的兩面性[12]，可能不同的實驗條件是最終結(jié)果的重要決定因素。在本研究中，與對照組相比，iNSIP和IPF患者BALF中IL- 10和GM-CSF顯著增加，吡非尼酮亦能有效抑制AMs中二者的釋放。

已知IL- 18、MIP- 1β和MIG、IP- 10(CXCL10)等CXC趨化因子在免疫應答中起著不同的作用：IL- 18、MIP- 1β是有效吸引和激活神經(jīng)營養(yǎng)因子的血管生成因子，而MIG、IP- 10是血管生成趨化因子，對Th1淋巴細胞和單核細胞上的CXC趨化因子受體3具有親和力，可被IFN-γ和TNF-α誘導[12，18]。IL- 18、MIP- 1β和MIG、IP- 10的不平衡表達參與各種間質(zhì)性肺病的發(fā)病機制，包括IPF和結(jié)節(jié)病[18]。在本研究中，iNSIP和IPF組患者AMs釋放較高水平的MIP- 1β和MIG、IP- 10(IL- 18除外)，而吡非尼酮能顯著抑制IL- 18、MIP- 1β和MIG、IP- 10釋放。通過抑制血管生成趨化因子IL- 18和MIP- 1β，吡非尼酮或許可以限制或逆轉(zhuǎn)IPF和iNSIP中的新血管形成，為治療肺纖維化提供更多的理論依據(jù)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，iNSIP和IPF組患者BLAF的AMs在體外可產(chǎn)生豐富的促炎、促纖維化因子，而吡非尼酮能顯著抑制這些細胞因子/趨化因子的釋放，且這種抑制作用在iNSIP和IPF組患者間無顯著差異。