佟 巍郭 智劉子洋潘思丹高 虹向志光

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,北京 100021)

實驗動物需要對自身攜帶的微生物進行控制,我國實驗動物國家標準對嚙齒類動物實驗動物的微生物和寄生蟲監(jiān)測做出了規(guī)定[1-2]。對實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境進行控制是微生物控制的有效的,也是必要的條件[3]。目前我國清潔級以及SPF 級實驗動物大、小鼠需要飼養(yǎng)在屏障環(huán)境或是隔離環(huán)境中。獨立通風籠具(individual ventilated cages,IVC)是應(yīng)用于實驗動物飼養(yǎng)的設(shè)備,其自身可以為動物提供潔凈空氣,同時維持與外界的靜壓差,可有效控制氣流走向。

每個IVC 籠盒可以視為一個小型的隔離器,但其與隔離器又有一些區(qū)別。主要區(qū)別在于,隔離器中飼養(yǎng)的動物,其日常的飲水、飼料、墊料的更換是無菌傳遞進行的,人與動物不直接接觸;而IVC 籠具在進行此類操作時,需要借助一個層流微環(huán)境,如生物安全柜或是換籠機等,在此類設(shè)備中需打開籠盒后進行換籠等操作,人和動物有直接接觸,人員操作是IVC 籠具更換時微生物感染的主要風險。因此,有必要對IVC 換籠進行規(guī)范化的管理。

本文對我單位制定的IVC 換籠標準操作程序的實施效果進行了評價。在ABSL-2 實驗室內(nèi),用小鼠易感病毒病原模擬感染實驗,對同一設(shè)施環(huán)境中不同位置籠具內(nèi)哨兵動物感染病原情況進行了監(jiān)測,進而測試使用該標準操作程序?qū)Σ《靖腥撅L險控制的有效性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

動物實驗在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所ABSL-2 實驗室進行。實驗動物為SPF 級雄性BALB/c 小鼠,6 周齡,(18±2)g,共 38 只,購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004],按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。本研究中實驗動物的使用經(jīng)過中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用和管理委員會的批準(XZG18001)。

1.1.2 病原

小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV)A59株源自美國ATCC,本室保存。

1.2 主要試劑

75%乙醇、“84”消毒液、QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN,Cat.No.52904);One Step RT-PCR Kit(Solarbio,T2240);MHV 病毒抗體免疫熒光法(Immunofluorescent antibody,IFA)檢測細胞抗原玻片(本室自制);MHV 病毒抗體酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒(蘇州西山生物技術(shù)有限公司,IM-692C)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

動物分為四組,分別為人工感染組、同籠架相鄰籠具哨兵組、相間籠架哨兵組,同設(shè)施內(nèi)IVC 系統(tǒng)外哨兵組。人工感染組20 只,其他各組6 只/組。人工感染組小鼠進行灌胃感染,使用病毒劑量為100TCID50。人工感染每周進行一次,共 4 次。各哨兵組同期飼育,僅在程序規(guī)定時間進行換籠操作。

1.3.2 IVC 籠具換籠標準操作程序

小鼠在實驗前3 d 進入設(shè)施,感染后,所有組動物每周進行換籠操作。IVC 籠具換籠標準操作程序基本內(nèi)容簡述如下:(1)使用生物安全柜或換籠機等設(shè)備進行籠具更換;(2)不同組別的動物在操作時應(yīng)該保持時間和空間的距離,若無法做到空間隔離操作時,應(yīng)以時間間隔來區(qū)分不同感染風險的動物組。即不同組動物使用同一換籠設(shè)備時,不同時操作,期間保證時間間隔,在對換籠設(shè)備進行消毒同時保證操作空間的自凈;(3)動物籠具表面、操作臺面等使用有效消毒劑消毒處理。本實驗動物籠具表面使用75%醫(yī)用消毒乙醇噴灑消毒,操作臺面使用有效氯含量250 mg/L 的“84”消毒液擦拭后使用紫外燈照射消毒30 min;(4)對籠具內(nèi)動物及籠具的接觸做好風險識別和處置,避免飲水、墊料、飼料在不同籠具間的交叉接觸。

1.3.3 小鼠血清中抗 MHV 抗體的 IFA 和 ELISA檢測

在小鼠感染3 周及5 周分別采集動物全血,4℃過夜后離心分離血清,血清經(jīng)56℃滅活30 min 后進行MHV 病毒抗體檢測。MHV 病毒抗體檢測使用自行制備的MHV 細胞抗原[4-6]及商品化的ELISA 試劑盒進行[5,7]。

1.3.4 小鼠糞便樣品MHV 核酸檢測

人工感染病毒組小鼠采集急性感染期糞便樣品,各哨兵組小鼠采集實驗5 周后糞便樣品,使用病毒RNA 核酸提取試劑盒提取病毒RNA 樣品,采用針對MHV 的PCR 方法進行檢測[8]。

2 結(jié)果

2.1 ABSL-2 實驗設(shè)施和IVC 設(shè)備的運行參數(shù)

本實驗在ABSL-2 實驗室進行,實驗的動物飼養(yǎng)間僅本實驗相關(guān)人員能夠進入。飼養(yǎng)間與相鄰準備間的靜壓差設(shè)定為-20 Pa,與外界的絕對靜壓差為-45 Pa。實驗室的溫度、濕度等均符合國家標準GB14925-2010 對小鼠飼養(yǎng)環(huán)境的要求。IVC 設(shè)備籠盒與外界的壓力梯度設(shè)定為-10 Pa?；\盒內(nèi)換氣次數(shù)達每小時50 次。

2.2 人工感染組小鼠病原學和血清學檢測

人工感染做小鼠感染后第6 天采集糞便樣品,MHV 病原 PCR 檢測可見 MHV 陽性擴增。感染病毒3 周后,隨機采集3 只小鼠全血,收集血清,IFA法與ELISA 法分別進行MHV 抗體檢測全部為陽性,IFA 法測定抗體滴度為 1:80～1 ∶160。

感染5 周后,采集剩余小鼠樣品,IFA 法與ELISA 法檢測,MHV 抗體均為陽性,IFA 法測定抗體滴度為 1 ∶640 ～ 1 ∶2560。糞便樣品 PCR 檢測,MHV 均有陽性擴增。

2.3 各哨兵組小鼠病原學和血清學均無陽性檢出

實驗感染5 周后,采集各對照組動物糞便樣品進行MHV 核酸檢測,各樣品均無MHV 特異擴增。采集各對照組小鼠全血,使用ELISA 和IFA 兩種方法進行MHV 抗體檢測,檢測結(jié)果均為陰性(表1)。

表1 實驗終末點各組MHV 檢測結(jié)果Table 1 Viral detection at the terminal point of the experiment

3 討論

實驗動物是一類特殊的動物,為了對其自身攜帶病原進行控制,需要使用物理屏障將實驗動物與感染風險進行隔離。通常采用屏障設(shè)施,或隔離設(shè)備來實現(xiàn)[3]。IVC 籠具的最大優(yōu)勢在于可在有限的空間內(nèi)飼養(yǎng)不同組的實驗動物。該類設(shè)備本身為每個籠盒內(nèi)的動物均提供了獨立的通風,每個獨立的IVC 籠盒可以作為一個單獨的系統(tǒng),用于飼養(yǎng)不同分組的實驗動物。理論上不同組動物飼養(yǎng)在不同的IVC 籠盒中,它們之間不存在微生物交叉感染的風險。但是此類設(shè)備在動物籠具墊料更換,飼料、飲水添加等過程中,需要使用公用的換籠設(shè)備。由于換籠操作多在同一空間,當使用同一設(shè)備進行換籠,動物之間仍存在一定的交叉感染風險。實驗動物IVC 籠具換籠的標準操作程序其控制的重點就在于對此交叉感染風險進行識別與控制。

既往的研究表明,在生物安全柜中的換籠操作有一定的交叉污染的風險[9],需要對換籠的具體操作做出標準操作程序的規(guī)定。如安全柜內(nèi)潔凈區(qū)與污染區(qū)的分區(qū)。接觸IVC 籠具內(nèi)材料的操作對于更換手套的要求等。本文采用的標準操作程序其要點在于將不同感染風險的動物進行分組操作。利用時間距離,實現(xiàn)對不同組動物交叉感染風險的控制。MHV 病原極易傳播,特別是A59 株既可通過消化道也可以通過呼吸道感染動物。本文做小鼠人工感染實驗,感染6 d 后小鼠糞便就有MHV 核酸檢出,此時,該動物已具有傳播病原的風險;在感染3 周時,人工感染小鼠已發(fā)生血清學轉(zhuǎn)化。各哨兵組動物與人工感染組共同飼育5 周時間,期間進行了4 次換籠操作。在充分的暴露周期內(nèi),哨兵組動物糞便沒有MHV 核酸檢出,也沒有發(fā)生MHV 抗體血清學轉(zhuǎn)化。本實驗結(jié)果表明,獨立通風籠具的這種換籠標準操作程序技術(shù)要求在小鼠病毒性病原感染風險的控制上是有效的。