石桂英白 琳

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,北京 100021)

隨著科學技術的發(fā)展,干細胞和再生醫(yī)學受到廣泛關注。人們對干細胞的了解日漸深入,對干細胞的種類和功能的探索日益廣泛,從而使干細胞在再生醫(yī)學領域擁有遠大的應用前景,同時為多種重大疾病的治療提供了新的思路和工具[1-3]。由于干細胞產品種類繁多、不同批次差異明顯、細胞復雜多變,因此對應用于臨床治療的干細胞制劑,進行質量控制尤為重要和關鍵[4-5]。干細胞作為活性外源物質,移植入機體后,機體會對這種外源刺激產生各種反應,如釋放細胞因子、產生免疫反應等[6-7]。因此,對干細胞的質量控制,需要了解干細胞進入機體后的各種反應,這就需要應用合適的動物模型。這種動物模型,既要能允許干細胞植入、分化,機體產生的反應又要最大程度與人體相似。普通動物有自身的免疫系統(tǒng),對移植的干細胞會產生排斥反應,這就影響了干細胞的植入效率;免疫缺陷動物模型,由于自身免疫缺陷不會排斥移植的外源干細胞,但是這種動物模型不能很好的反映干細胞進入人體的反應;為了能更好的模擬人體免疫環(huán)境,人們構建了人源化小鼠。人源化小鼠是在免疫缺陷小鼠體內建立了人的免疫系統(tǒng),因此,干細胞移植到人源化小鼠后,既保證了移植效率,又能模擬人體的反應。因此采用免疫缺陷小鼠和人源化小鼠,可以更好的模擬干細胞移植后人體免疫反應,更加準確的評價干細胞產品的安全性。因此,本文綜述了免疫缺陷小鼠和人源化小鼠在干細胞質量控制、干細胞治療評價中的應用成果,期望通過對已有研究的總結為干細胞臨床前安全性評價的標準化提供資料和信息。

1 干細胞的免疫原性

干細胞種類較多,根據(jù)分化能力可分為全能干細胞,如胚胎干細胞;多能干細胞,如造血干細胞、誘導多能干細胞、間充質干細胞等。干細胞表達的一些蛋白質或者復合物具有免疫原性[5-8]。如人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hESCs)表達主要組織相容性抗原復合物Ⅰ類分子和ABO 抗原,可激活機體免疫反[4,6-7];核轉移胚胎干細胞(nuclear transfer embryonic stem cells,NT-ESCs),是將成纖維細胞的核轉入去核的卵母細胞中,這種細胞含有卵母細胞的線粒體抗原,可以激活T 細胞,產生免疫排斥反應[7];誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的免疫原性主要來自于其表觀遺傳學改變、蛋白編碼突變和融合蛋白[6-7];間充質干細胞(mesenchymal stromal/stem cells,MSC)表達人白細胞抗原Ⅰ類分子(human leucocyte antigen,HLA)可以激活免疫應答[8]。不同干細胞的免疫原性見表1。

另外,有些干細胞,如間充質干細胞,其治療效果主要通過調節(jié)機體免疫反應發(fā)揮作用,在評價其安全性和有效性時,動物模型自身的免疫反應會影響實驗結果,不能反映干細胞的真實作用;應用免疫缺陷動物能真實反映干細胞的作用,而應用人源化動物,則可以反映人的免疫系統(tǒng)對干細胞的應答情況,更有利于了解干細胞植入人體后的機體反應[9]。

2 免疫缺陷小鼠模型

免疫缺陷小鼠是指免疫功能缺陷的小鼠,通常是由先天性遺傳突變導致,或者用人工方法培育而成[10]。根據(jù)免疫細胞缺失種類的不同,可以分為:1.T 淋巴細胞功能缺陷小鼠:裸小鼠是最早發(fā)現(xiàn)的免疫缺陷小鼠,先天無胸腺,從而導致T 淋巴細胞缺失。裸小鼠的發(fā)現(xiàn)和應用是免疫缺陷動物研究和應用的起點,其在免疫學、腫瘤學、細胞生物學等領域得到普遍應用;2.B 淋巴細胞功能缺陷小鼠:CBA/N 小鼠是X 染色體連鎖的B 細胞功能缺陷小鼠,可用于研究B 淋巴細胞的產生、功能等,在免疫、炎癥及自身免疫疾病的研究中有廣泛應用;3.NK細胞功能缺陷小鼠:Beige 小鼠是NK 細胞活性缺陷的突變小鼠,用于器官移植等研究;4.聯(lián)合免疫缺陷小鼠:即多種免疫細胞或功能同時缺失或缺陷的小鼠,如SCID 小鼠是T、B 細胞聯(lián)合免疫缺陷小鼠;BNSG 小鼠是 T、B、NK 三聯(lián)免疫缺陷小鼠。

表1 不同干細胞的免疫原性Table 1 Immunogenicity of different Stem Cells

目前常用的聯(lián)合免疫缺陷小鼠有SCID 小鼠、NOD/SCID 小鼠、NSG、NRG 小鼠等。SCID 小鼠是由于Prkdc(protein kinase DNA-activated catalytic)基因突變,導致功能性T 淋巴細胞和B 淋巴細胞缺失,但有正常的NK 細胞,表現(xiàn)為細胞免疫和體液免疫的重度聯(lián)合免疫缺陷[11]。SCID 小鼠廣泛應用于腫瘤學、免疫學、微生物學、生殖醫(yī)學等領域。SCID小鼠的缺點是滲漏現(xiàn)象,即少量小鼠在青年期有部分免疫功能恢復,這種滲漏現(xiàn)象不會遺傳[12]。NOD/SCID 小鼠,即非肥胖性糖尿病免疫缺陷小鼠,是SCID 小鼠與NOD 小鼠即非肥胖性糖尿病小鼠回交獲得的免疫缺陷小鼠[13]。與 SCID 小鼠相比,NOD/SCID 小鼠的NK 細胞活性低,免疫恢復幾率更低,各種腫瘤細胞可移植到NOD/SCID 小鼠體內,排斥反應和移植物抗宿主病的發(fā)生率更低。NSG 小鼠即 NOD/scid/gamma 小鼠,是在 NOD/SCID 小鼠基礎上敲除了 IL-2 受體 γ 鏈基因[14]。IL-2 受體γ 鏈是多種細胞因子的共同受體亞基,這些細胞因子包括 IL2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和 IL-21等,它們都具有重要的免疫功能。IL2 受體γ 鏈基因敲除后,小鼠機體免疫功能降低,特別是NK 細胞,其活性幾乎喪失,小鼠出現(xiàn)重度免疫缺陷表型,沒有成熟的T 淋巴細胞、B 淋巴細胞和功能性NK細胞,同時細胞因子的信號傳遞能力缺失[15-16]。NSG 小鼠是目前世界上免疫缺陷程度最高的工具小鼠;在多個領域都有廣泛應用,如免疫學、感染性疾病、干細胞生物學等。NRG 小鼠即 NOD/rag/gamma 小鼠,是在NOD 的背景下敲除了Rag1 和IL-2 受體γ 鏈基因,NRG 小鼠對輻射和基因毒性藥物的耐受性更強,更適用于細胞和組織移植研究[17]。另外在NSG 小鼠基礎上進行基因修飾,衍生出多個免疫缺陷小鼠品系,如NSG B2m、NSG-SGM3 等,這些小鼠在異種移植中更有優(yōu)勢[18-19]。

3 人源化小鼠模型

人源化小鼠模型是指帶有功能性的人類基因、細胞或組織的小鼠模型[15]。人源化小鼠的構建,包含供體細胞和免疫缺陷小鼠兩個方面。曾經(jīng)使用的供體細胞包括人外周血單個核細胞、人外周血淋巴細胞、臍帶血造血干細胞、動員后的成熟造血干細胞,以及胚胎肝、胸腺組織等?？梢赃x用的免疫缺陷小鼠包括早期使用的裸小鼠,以及后來發(fā)展起來的 SCID 小鼠、NOD/SCID 小鼠、NSG 小鼠等。供體細胞和作為受體的免疫缺陷小鼠都會影響人源化小鼠的人源化效果,從而影響人源化小鼠的應用。

早期構建人源化小鼠模型,是將人外周血單個核細胞或外周血淋巴細胞移植到裸小鼠體內,由于裸小鼠只是T 淋巴細胞缺失,而其它免疫細胞正常,出現(xiàn)免疫排斥反應,影響移植效果[11]。隨著科技發(fā)展,人們分離出各種類型的造血干細胞,如臍帶血來源的造血干細胞、動員后的成熟造血干細胞等,都成為良好的供體細胞。同時,人們也培育出新的免疫缺陷小鼠,其免疫缺陷程度更加嚴重,有利于移植細胞的存活、分化等。

骨髓-肝-胸腺(bone marrow-liver-thymus,BLT)人源化小鼠是人源免疫系統(tǒng)重建最完善的小鼠模型[20]。構建BLT 人源化小鼠,需要對免疫缺陷小鼠進行半致死劑量的照射,將同一個體來源的人胚胎肝和胸腺組織塊植入小鼠腎包膜下,再輸入同一個體的造血干細胞。BLT 人源化小鼠模型的人源化環(huán)境更強,輸入的人造血干細胞可以分化成多個細胞系,包括T 細胞、B 細胞、單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、紅細胞、血小板等。BLT 人源化小鼠還建立了人粘膜免疫系統(tǒng)和二級淋巴組織,并且能產生人源性的適應性免疫應答,如生成IgM、IgG 等免疫球蛋白。所以,BLT 人源化小鼠對植入的外源性組織或細胞的免疫應答反應更接近人類機體自然反應。BLT 人源化小鼠的構建和應用,促進了感染性疾病、腫瘤、再生醫(yī)學、免疫學、干細胞治療等研究領域的發(fā)展[21-25]。

4 免疫缺陷和人源化小鼠模型在干細胞質量控制中的應用

目前國內外已開展了多項干細胞臨床應用研究[1-4],應用免疫缺陷小鼠和人源化小鼠進行臨床前研究,對多種細胞進行體內研究,評價其安全性和有效性。如對造血干細胞的相關研究,了解了造血干祖細胞在體內擴增、歸巢、植入及分化機制[26-28];對人iPSC 來源的平滑肌細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞的研究,發(fā)現(xiàn)由于免疫原性抗原的異常表達,兩種分化細胞的免疫原性不同[29];對犬iPSC 來源的MSC[30]、人羊膜上皮細胞[31]及其來源的肝細胞樣細胞[32]、人成纖維細胞轉分化的胰島素分泌細胞[33]、胚胎干細胞來源的星形膠質細胞[34]等的安全性研究,發(fā)現(xiàn)這些細胞均無成瘤性和促瘤性;應用免疫缺陷小鼠構建構建疾病模型,評價造血干祖細胞治療的有效性[35];人羊膜上皮細胞來源的肝細胞樣細胞對急性肝損傷有治療作用[32];博來霉素誘導人源化小鼠肺纖維化模型,注射人MSC 可以調節(jié)T 細胞紊亂,減輕肺纖維化程度[36];胚胎干細胞來源的星形膠質細胞對肌萎縮性嵴髓側索硬化癥有治療效果[34]。綜上可見,免疫缺陷小鼠和人源化小鼠在干細胞質量控制中發(fā)揮重要作用,為干細胞治療的安全性和有效性提供科學依據(jù)。安全性評價包括毒性實驗、致瘤性實驗、促瘤性實驗等。

4.1 毒性實驗

干細胞制劑中即有干細胞,又有維持干細胞活性的支持物質,而且不同種類和不同批次的干細胞差異較大。因此,有必要對干細胞制劑進行毒性實驗。干細胞的毒性實驗可分為急性毒性實驗和長期毒性實驗[2]。實驗中,干細胞植入動物體內的途徑主要是靜脈注射,包括尾靜脈注射和眼球后靜脈叢注射兩種方式[30,32,37-38],以及治療部位的原位注射[34]。急性毒性實驗通常采用單次或多次大劑量細胞注射,一般細胞用量為每千克1×108～2.5×108細胞,注射細胞后觀察 4 ～10 周[34,37-39]。長期毒性實驗中注射細胞的劑量為每千克2.5×106～5×107細胞體重,注射細胞后觀察3～4 個月[31,34,37-39]。觀察及檢測指標包括體重、行為、血常規(guī)、細胞因子、病理變化等。對人骨髓間充質干細胞、羊膜間充質干細胞及CART19 等細胞的研究中,未發(fā)現(xiàn)明顯的急性或長期毒性反應[31,34,37-39]。

4.2 致瘤性實驗

干細胞具有自我更新和增殖能力,且其生長調節(jié)機制類似腫瘤細胞,已有研究表明,人胚胎干細胞和誘導多能干細胞可在動物體內可形成良性或惡性畸胎瘤。干細胞制劑同樣存在致瘤性的可能,因此,對于干細胞制劑有必要檢測其腫瘤形成能力。已有研究中,干細胞致瘤性實驗,多采用NSG小鼠為受體,在其背部皮下注射干細胞,細胞劑量為 5× 104～ 5 × 106細胞/注射點,注射后每天觀察腫瘤形成情況,觀察時間 20 ～50 周[31,32,34,37-40]。在角質形成細胞、羊膜上皮干細胞、皮膚成纖維細胞、人骨髓間充質干細胞等致瘤性研究中,均未發(fā)現(xiàn)腫瘤形成[31,32,34,37-40]。

4.3 促瘤性實驗

除了自身形成腫瘤,干細胞還可以影響體內已有腫瘤的生長增殖,這就是干細胞的促瘤性。為檢測干細胞制劑對腫瘤生長是否有影響,可在免疫缺陷小鼠注射腫瘤細胞系的同時注射干細胞,以觀察干細胞制劑對腫瘤形成及生長的作用[31,32,34,37-40]。腫瘤細胞可用3×106HeLa 或Raji 腫瘤細胞,干細胞用量為 5×104～5×106細胞,注射后每天觀察腫瘤形成情況,觀察時間20 ～50 周。羊膜上皮細胞對腫瘤形成及生長無顯著影響[31,32,34,37-40]。

5 展望

在干細胞制劑的質量控制和安全性評價中,動物模型,尤其是免疫缺陷小鼠模型和人源化小鼠模型發(fā)揮了極大作用。隨著科技的發(fā)展,免疫缺陷小鼠和人源化小鼠品系日益增多,其免疫缺陷程度越來越高,也能更好地模擬人體對干細胞制劑的反應,這將更有利于各種干細胞制劑的評價和質量控制,從而為干細胞治療提供科學依據(jù)。從已有研究看,多種干細胞都沒有顯著的毒性、致瘤性、促瘤性等,說明干細胞制劑的安全性是可靠的。但是干細胞治療的有效性,需要相應的疾病動物模型進行評價,這就需要構建出各種疾病動物模型,從而為干細胞治療的有效性提供科學依據(jù)。