張英英單海軍婁元俊郭 鑫
(河南省中醫(yī)院兒童腦病康復科,鄭州 450002)
癲癇是小兒時期常見的神經(jīng)系統(tǒng)綜合征。托吡酯屬于一種廣譜抗癲癇新藥,既往研究證實該藥物可顯著控制小兒癲癇的發(fā)作癥狀,但綜合效果仍有待改進[1]。中醫(yī)學認為,小兒癲癇可歸屬于“癇證”范疇,多為胎中受驚、遺傳缺陷、產(chǎn)時損傷等所致,應以抗癇增智為治則。已有研究證實抗癇增智顆粒對小兒癲癇的療效確切[2]。但目前人們關于抗癇增智顆粒治療小兒癲癇的作用機制認識尚淺。Toll 樣受體 4 (TLR4)/高遷移率族蛋白 1(HMGB1)通路可參與海馬神經(jīng)元的生長、增殖和凋亡,是目前公認的小兒癲癇治療的靶點[3-4]。核因子抑制蛋白 α(IκB-α)是 TLR4/HMGB1 信號通路下游蛋白,磷酸化 IκB-α(p-IκB-α) 可受 TLR4/HMGB1 通路的調(diào)控參與小兒癲癇海馬神經(jīng)元病理變化[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[6]癲癇模型海馬區(qū)TLR4/HMGB1/p-IκB-α 通路被激活,可導致神經(jīng)元變性壞死,學習/記憶能力減弱,還可加重海馬區(qū)組織病理改變,因此可將該通路作為癲癇治療的靶點。然而抗癇增智顆粒是否可調(diào)控該通路減輕小兒癲癇海馬神經(jīng)元病理改變尚未可知。鑒于此,本研究特設計SD 幼鼠對照試驗,對比不同濃度抗癇增智顆粒藥液與托吡酯對癲癇幼鼠行為學、學習/記憶能力、海馬區(qū)神經(jīng)元病理的影響,并探討前者對TLR4/HMGB1/p-IκB-α 通路是否有調(diào)控作用及其具體機制。
清潔級SD 幼鼠近交系60 只,雌雄各半,3 周齡,50~70 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2018-0001],動物在鄭州大學實驗動物中心飼養(yǎng)[SYXK(豫)2018-0003],經(jīng)鄭州大學實驗動物中心動物倫理審批(IACUC-20180512-13),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。
托吡酯(西安楊森制藥有限公司,25 mg,批號:201708001);抗癇增智顆粒(天津中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院杏林藥廠,每克相當于生藥含量1.5 g,批號:201710007);戊四氮(PTZ)(上海博頓生物化工有限公司,純度≥98%,批號:20170415A);4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(北京華科盛精細化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公 司,批 號: 20170813C); TRIzol 試 劑 ( 美 國Invitrogen 公司,批號:YY17051801A);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術,批號:20171104B);蛋白定量檢測試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司,批號:170213004);兔抗鼠 TLR4、HMGB1、IκB-α、p-IκB-α 單克隆抗體,山羊抗兔 TLR4、HMGB1、IκB-α、p-IκB-α 多克隆抗體(酶標記)(美國 ACDAM公 司,批 號: 170705001、170528003、170517007、170708006、170530001、170520012)。
水迷宮(直徑130 cm、高50 cm、水深30 cm)(美國NatureGene 公司);C1000 型聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(美國BioRad 公司);DYCZ-20G 基因電泳儀(北京六一儀器廠);LG10 型離心機(北京醫(yī)用離心機廠);Trans-Blot 型轉(zhuǎn)膜儀(美國 BioRad 公司);DYCZ-24A 型蛋白電泳儀(北京六一儀器廠)。
1.3.1 實驗動物分組、建模
于60 只SD 幼鼠中隨機取10 只記為正常組,余50 只建立癲癇模型。建模方法:腹腔注射PTZ,60 mg/kg,單次給藥。按照Racine 分級標準[7],發(fā)作次數(shù)≥4 級且持續(xù)時間≥30 min 認為建模成功。將建模成功的大鼠隨機分組。陽性組予以托吡酯5.9 mg/kg 溶于2 mL/100 g 生理鹽水中灌胃,低濃度組、中濃度組、高濃度組予以抗癇增智顆粒藥液灌胃,抗癇增智顆粒質(zhì)量分別是 1.28 g/kg、2.56 g/kg、5.12 g/kg,模型組和正常組予以生理鹽水灌胃,均每天1 次,干預4 周。
1.3.2 干預前后行為學、學習/記憶能力評價
采用Racine 分級標準分別于干預前后評價行為學,0 級認為無癲癇發(fā)作,1 級認為點頭或頭部抽搐,2 級認為有全身肌陣攣,3 級認為有頭部抽搐加前肢陣攣,4 級認為跌倒,5 級認為全身強直-陣攣性驚厥,分級越高行為學異常越嚴重;分別于干預前后采用Morris 水迷宮實驗評價學習/記憶能力,水溫控制(24±2)℃。檢測前需進行適應性訓練,連續(xù)5 d 后測定幼鼠搜索平臺時間、在原平臺象限探索時間百分比,具體參照說明書檢測。
1.3.3 海馬區(qū)病理變化
干預后以4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注固定,迅速取大腦海馬區(qū)組織,石蠟包埋、連續(xù)切片、HE 染色,具體按照試劑盒說明書操作。對神經(jīng)元損傷程度進行分級,將未見神經(jīng)元損傷記為0 級;將有散在神經(jīng)元損傷記為1 級;將有片狀神經(jīng)元損傷記為2 級;將幾乎全部神經(jīng)元損傷記為3 級。
1.3.4 海馬區(qū) TLR4、HMGB1 mRNA 表達檢測
剝離新鮮的海馬區(qū)組織,采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR(qRT-PCR)檢測,液氮研磨,加入TRIzol 試劑,提取總核糖核酸,鑒定后采用全式金逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,配置PCR 反應體系。TLR4 上游引物序列: 5’-ACGTGCTAGATCGATATAGCTA GAT-3’,下游引物序列:5’-CTGATAGCTAGATTT AGCTATAGCTAGATCGAT-3’;HMGB1 上游引物序列: 5 ’-TAGGCTGCGCGCGTAGCTAGATCGATGAT-3’; 下 游 引 物 序 列: 5’-AGCTAGATCGATTTT AGCTAGAGCATGAT-3’;內(nèi)參為 β-actin,上游引物序 列: 5’-TAGCTAGATAGCTATGATCTAGATTAGC TAG-3’,下游引物序列:5’-TAGCTAGATAGCTAT AGCTATATGCATAGCTA-3’。93℃ 2 min,40 個循環(huán):92℃ 1 min、72℃ 1.5 min、54℃ 1 min,最后 72℃5 min。計算相對表達量。
1.3.5 海馬區(qū) TLR4、HMGB1、IκB-α 蛋白表達及 p-IκB-α 檢測
同上述方法取海馬區(qū)組織,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測。裂解勻漿,抽提離心分離,取蛋白定量檢測試劑盒定量。取40 μg 樣品加入上樣緩沖液加熱變性,轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗,溫室過夜,洗膜;加入二抗,37℃雜交2 h。洗膜、顯影,計算目的相對表達量。
采用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,計數(shù)資料分布采用秩和檢驗;多樣本計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)單因素方差分析,并以SNK-q檢驗每2 樣本差異。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
50 只SD 幼鼠中共有43 只建模成功,建模成功率為86.00%,將建模成功的SD 幼鼠隨機分為模型組、陽性組、低濃度組、中濃度組和高濃度組,分別有 9 只、8 只、9 只、9 只和 8 只。Racine 分級結(jié)果:正常組:干預前0 級有10 只,干預后0 級有10 只;模型組:干預前 4 級 6 只、5 級 3 只,干預后 4 級 7只、5 級 2 只;陽性組:干預前 4 級 4 只、5 級 4 只,干預后 2 級、3 級、4 級、5 級均 2 只;低濃度組:干預前4 級 5 只、5 級 4 只,干預后 3 級 4 只,4 級 3 只,5 級2 只;中濃度組:干預前 4 級 4 只、5 級 5 只,干預后 1級 1 只,2 級、3 級、4 級、5 級均 2 只;高濃度組:干預前 4 級 4 只、5 級 4 只,干預后 1 級 3 只,2 級 4 只,3級1 只。干預前模型組、陽性組、低濃度組、中濃度組和高濃度組Racine 分級與正常組差異均有統(tǒng)計學意義(Z=7.063、7.587、7.412、7.069、7.185,均P=0.000),干預后陽性組、低濃度組、中濃度組和高濃度組Racine 分級與干預前差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(Z= 15.836、11.207、16.309、21.235,均P=0.000),且3 濃度組的作用呈劑量依賴性,中濃度組與陽性組相當。
干預前后各組幼鼠搜索平臺時間差異均有統(tǒng)計學意義(F=38.975、59.303,均P=0.000),在原平臺象限探索時間百分比對比差異也均有統(tǒng)計學意義(F=41.202、67.385,均P=0.000)。干預后正常組、模型組均與干預前相近(t=0.268、0.135,P=0.812、0.907;t=0.976、0.803,P=0.101、0.315)。干預后陽性組、低濃度組、中濃度組和高濃度組搜索平臺時間均較本組干預前縮短(t= 22.463、17.385、23.209、46.745,均P=0.000),在原平臺象限探索時間百分比均較干預前減少(t= 16.975、10.266、18.376、24.253,均P=0.000);干預后與模型組比較,陽性組、低濃度組、中濃度組和高濃度組搜索平臺時間均較本組干預前縮短(t= 22.746、18.905、23.204、29.763,均P=0.000),在原平臺象限探索時間百分比均較干預前減少(t= 14.482、9.105、15.306、22.478,均P=0.000);干預后陽性組、中濃度組和高濃度組搜索平臺時間均短于低濃度組(t=16.989、16.713、25.302,均P=0.000),在原平臺象限探索時間百分比均少于低濃度組(t=13.143、13.296、22.478,均P=0.000);干預后高濃度組搜索平臺時間短于陽性組和中濃度組(t=10.365、10.926,均P=0.000),在原平臺象限探索時間百分比少于陽性組和中濃度組(t= 9.771、9.582,均P=0.000)。見圖1。
正常組海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊致密、邊緣清晰,細胞呈圓形或橢圓形,核仁清晰,染色質(zhì)均勻,形態(tài)正常;模型組海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂,可見變性、壞死,神經(jīng)元細胞腫脹、細胞核碎裂/溶解,神經(jīng)元嚴重缺失,可見嚴重嗜神經(jīng)現(xiàn)象;低濃度組海馬區(qū)神經(jīng)元排列散亂,有變性,部分神經(jīng)元壞死、細胞核碎裂,有明顯神經(jīng)元缺失、嗜神經(jīng)現(xiàn)象;陽性組和中濃度組海馬區(qū)神經(jīng)元部分排列紊亂,有變性,少部分神經(jīng)元壞死,有神經(jīng)元缺失、輕微嗜神經(jīng)現(xiàn)象;高濃度組海馬區(qū)神經(jīng)元多排列整齊,邊緣清晰,部分神經(jīng)元細胞腫脹,少見變性、壞死。見圖2。海馬區(qū)神經(jīng)元損傷分級對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與正常組比較,模型組分級升高(t=11.320,P=0.000);與模型組比較,陽性組、低濃度組、中濃度組、高濃度組分級均下降(t= 5.271、2.142、5.283、7.414,P=0.000、0.048、0.000、0.000);陽性組、中濃度組和高濃度組分級均低于低濃度組(t=3.035、2.979、4.920,P=0.008、0.009、0.000);高濃度組分級低于陽性組、中濃度組(t= 2.447、2.681,P=0.027、0.017)。見表1。
各組幼鼠海馬區(qū)組織TLR4、HMGB1 mRNA 表達對比差異均有統(tǒng)計學意義(F=19.878、18.706,均P=0.000);與正常組比較,模型組幼鼠海馬區(qū)組織TLR4、HMGB1 mRNA 表 達 均 升 高 (t= 36.976、35.803,均P=0.000),陽性組、低濃度組、中濃度組和高濃度組幼鼠海馬區(qū)組織TLR4、HMGB1 mRNA表達均低于模型組(t= 33.072、46.286、32.716、66.597,均P= 0.000;t= 31.307、44.269、32.026、64.383,均P=0.000);陽性組、中濃度組和高濃度組幼鼠海馬區(qū)組織TLR4、HMGB1 mRNA 表達均低于低濃度組(t= 22.017、20.185、35.696,均P=0.000;t=21.203、19.875、34.302,均P=0.000);高濃度組幼鼠海馬區(qū)組織TLR4、HMGB1 mRNA 表達均低于陽性組、中濃度組(t=12.165、11.859,均P=0.000;t=11.312、10.097,均P=0.000)。見圖3。
圖1 干預前后學習/記憶能力變化柱狀圖Figure 1 Histogram of learning/memory ability changes before and after intervention
各組幼鼠海馬區(qū)組織TLR4、HMGB1 蛋白表達及p-IκB-α 水平對比差異均有統(tǒng)計學意義(F=75.763、71.289、46.315,均P=0.000);與正常組比較,模型組幼鼠海馬區(qū)組織TLR4、HMGB1 蛋白表達及 p-IκB-α 水平均升高(t=34.312、39.306、41.252,均P=0.000),陽性組、低濃度組、中濃度組和高濃度組幼鼠海馬區(qū)組織TLR4、HMGB1 蛋白表達及p-IκB-α 水 平 均 低 于 模 型 組 (t= 35.206、41.863、36.704、88.915,均P= 0.000;t= 30.207、40.589、34.302、84.071,均P= 0.000;t= 15.968、14.207、16.806、22.283,均P=0.000);陽性組、中濃度組和高濃度組幼鼠海馬區(qū)組織TLR4、HMGB1 蛋白表達及 p-IκB-α 水 平 均 低 于 低 濃 度 組 (t= 26.158、19.302、33.187,均P= 0.000;t= 21.289、17.635、31.307,均P=0.000;t=18.163、11.202、22.071,均P= 0.000);高濃度組幼鼠海馬區(qū)組織 TLR4、HMGB1 蛋白表達及 p-IκB-α 水平均低于陽性組、中濃度組(t=16.985、17.315,均P=0.000;t=15.342、15.038,均P= 0.000;t= 10.313、10.971,均P=0.000);各組幼鼠海馬區(qū)組織IκB-α 蛋白表達均相近(F=1.206,P=0.414)。見圖4、圖5。
表1 海馬區(qū)神經(jīng)元損傷分級對比( ±s;級)Table 1 Comparison of neuronal injury grades in hippocampus ( ±s; grades)
表1 海馬區(qū)神經(jīng)元損傷分級對比( ±s;級)Table 1 Comparison of neuronal injury grades in hippocampus ( ±s; grades)
注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與陽性組比較,@ P < 0.05; 與 低 濃 度 組 比 較,&P < 0.05; 與 中 濃 度 組 比較,aP<0.05。Note.Compared with the Normal group,*P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Compared with the positive group,@P<0.05.Compared with the low concentration group,&P<0.05.Compared with the medium concentration group,aP<0.05.
組別Groups n 分級Grades正常組Normal group 10 0.90±0.30模型組Model group 9 2.78±0.42*陽性組Positive group 8 1.63±0.48*#低濃度組Low concentration group 9 2.33±0.47*#@中濃度組Medium concentration group 9 1.67±0.47*#&高濃度組High concentration group 8 1.13±0.34*#@&a F/108.765 P/0.000
腦部神經(jīng)元同步化異常放電是癲癇的基本特征,可損傷神經(jīng)系統(tǒng)功能[8-9]。目前發(fā)現(xiàn)癲癇患兒以海馬硬化、神經(jīng)元丟失、大腦膠質(zhì)細胞增生為病理基礎,且海馬神經(jīng)元變性、凋亡等病理變化可直接影響病情與預后,故減輕小兒癲癇海馬神經(jīng)元病變尤為重要。
圖2 海馬區(qū)神經(jīng)元病理變化(HE 染色)Figure 2 pathological changes of hippocampal neurons(HE staining)
圖3 海馬區(qū)組織TLR4、HMGB1 mRNA 表達柱狀圖Figure 3 Histogram of TLR4 and HMGB1 mRNA expressions in hippocampus
圖4 海馬區(qū)組織 TLR4、HMGB1、IκB-α 蛋白表達及 p-IκB-α 水平Figure 4 TLR4,HMGB1,IκB-α protein expression and P-IκB-α level in hippocampus
圖5 海馬區(qū)組織 TLR4、HMGB1、IκB-α 蛋白表達及 p-IκB-α 水平柱狀圖Figure 5 Histogram of expressions of TLR4,HMGB1,IκB-α protein and histogram of P-IκB-α level in hippocampus
小兒癲癇可出現(xiàn)行為學改變、學習/記憶能力下降等問題,而此類表現(xiàn)與海馬神經(jīng)元病理變化密切相關。本次研究中,干預后陽性組和3 濃度組行為學Racine 分級、學習/記憶能力均較本組干預前和模型組干預后顯著改善,且干預后高濃度組作用最佳,顯著優(yōu)于陽性組,可知抗癇增智顆??筛纳瓢d癇幼鼠的行為學和學習/記憶能力,且高濃度的抗癇增智顆粒的作用優(yōu)于托吡酯??拱B增智顆粒由鹿茸、石菖蒲、菟絲子、膽南星、天麻、茯苓、陳皮、半夏、僵蠶、全蝎、冰片、甘草組成,善用活血通絡、行氣補血、通腦養(yǎng)神的中藥材,可開竅醒腦、醒神益智,兼具祛邪扶正、顧護營衛(wèi),可達抗癇益智的功效。有既往報道證實抗癇增智類中成藥對癲癇幼鼠有治療作用[10],與本次研究結(jié)果相符。本研究病理檢測結(jié)果還發(fā)現(xiàn),陽性組和3 濃度組海馬神經(jīng)元病理變化均較模型組減輕,且高濃度組作用最佳,且病理分級對比結(jié)果與上述描述相一致,表明抗癇增智顆??捎行p輕癲癇幼鼠海馬神經(jīng)元病變。
癲癇海馬神經(jīng)元病理變化與腦內(nèi)炎癥反應、免疫應答激活密切相關[11]。TLR4 是識別病原相關分子模式的受體,在誘導癲癇發(fā)作的過程中,PTZ 可被機體TLR4 識別引發(fā)免疫反應,活化TLR4 基因與蛋白表達,建立癲癇模型[12]。HMGB1 則屬于核染色質(zhì)成分,正常情況下其存在于細胞核,癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元凋亡可釋放大量HMGB1,且HMGB1 也可被TLR4 識別并激活,因此HMGB1 的表達水平被認為是衡量細胞凋亡率的重要指標[13-14]。正常生理條件下活化核轉(zhuǎn)錄因子κB 可與調(diào)節(jié)蛋白κB 抑制劑相結(jié)合生成IκB-α,以失活狀態(tài)穩(wěn)定存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到外源性刺激,TLR4/HMGB1 通路激活,活化核轉(zhuǎn)錄因子κB 活化,可轉(zhuǎn)移入細胞核進而促進炎癥反應,IκB-α 磷酸化水平增加,且炎癥反應可參與海馬神經(jīng)元損傷,誘導癲癇發(fā)作[15]。國外 Walker 等[16]研究表明 TLR4/HMGB1/p-IκB-α 通路可作為癲癇治療的作用靶點,可調(diào)控該通路減輕癲癇模型海馬組織損傷。本次研究中,模型組TLR4、HMGB1 mRNA、TLR4、HMGB1 蛋白的相對表達量、p-IκB-α 水平均較正常組顯著升高,陽性組和3 濃度組均較模型組顯著下降,且高濃度組指標均優(yōu)于陽性組,提示抗癇增智顆??赡苣軌蛲ㄟ^調(diào)控TLR4/HMGB1/p-IκB-α 通路減輕癲癇幼鼠海馬神經(jīng)元病變,且呈劑量依賴性,其中高濃度抗癇增殖顆粒對該信號通路的抑制效果優(yōu)于托吡酯。
綜上,抗癇增智顆粒可改善癲癇幼鼠的行為學、學習/記憶能力,還可減輕海馬神經(jīng)元損傷,其中高濃度藥物的作用顯著優(yōu)于托吡酯,推測是通過抑制 TLR4/HMGB1/p-IκB-α 通 路 被 激 活,下 調(diào)TLR4、HMGB1 表達,控制 p-IκB-α 水平實現(xiàn)此作用的。