四神丸對腹瀉型腸易激綜合征大鼠脊髓Ghrelin、GHSR表達的影響*

藺曉源 鄧 娜 夏旭婷 蔡 瑩 劉富林

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

中醫(yī)經(jīng)典名方四神丸臨床用于治療腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）效果顯著［1-2］，但其作用靶點卻不清楚。IBS-D以反復(fù)發(fā)作的腹部不適、腹痛、腹瀉為主要表現(xiàn)，發(fā)病機制尚不明確，至今亦無最佳治療方案，雖不會嚴重威脅患者生命，但其癥狀遷延反復(fù)，對患者生活質(zhì)量造成的影響遠比器質(zhì)性疾病更嚴重［3］。目前一致認為，基于腦腸肽作用的腦腸軸調(diào)控紊亂在IBS-D的發(fā)病中起重要作用［4］。胃促生長素（Ghrelin）是一種重要的興奮性腦腸肽，Ghrelin及其受體GHSR在胃腸道、下丘腦、脊髓中均有分布，并在IBS-D的發(fā)病中起關(guān)鍵作用［5］。為了進一步明確四神丸治療IBS-D的中樞神經(jīng)機制，本研究觀察了其對IBS-D模型大鼠脊髓組織Ghrelin、GHSR表達的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠60只，SPF級，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-002。飼養(yǎng)溫度21～25℃，濕度50%～70%。

1.2 實驗藥物

四神丸（北京同仁堂天然藥物唐山有限公司，國藥準字Z13020656；主要成分為肉豆蔻、補骨脂、五味子、吳茱萸、大棗）研磨后用純凈水配成高、中、低質(zhì)量濃度（0.732、0.366、0.183 g/mL）的藥液備用。得舒特（法國蘇威制藥公司，注冊證號H20120127）用純凈水配成質(zhì)量濃度為1.523 mg/mL的藥液備用。番瀉葉（購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥藥房，經(jīng)鑒定符合國家藥典標準）按100 g加沸水400 mL比例浸泡30 min后再煮3 min，濃縮成1.0 g/mL的水煎液備用。

1.3 試劑與儀器

Ghrelin、GHSR鼠抗多克隆抗體（Abcam），SP-9000免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA），PCR試劑盒（KAPA Biosystems）。3050S冷凍切片機（徠卡），IX71顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)（奧林巴斯），Realplex2熒光定量PCR儀（Eppendorf），T100梯度PCR擴增儀、Cheemi-Doc XRS+Imager化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（美國BIO-RAD）。

1.4 分組與造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機取10只作為正常組，其余50只參考文獻方法采用番瀉葉灌胃+避水應(yīng)激方法建立脾腎陽虛型IBS-D大鼠模型［6］：造模動物給予番瀉葉水煎液灌胃（10 mL/kg），每天1次，連續(xù)28 d后開始進行避水應(yīng)激。取一透明玻璃水槽，中央有一島樣小平臺，水槽內(nèi)注滿水，距平臺面下1 cm，每天上午9∶00～11∶00將造模大鼠置于平臺上，每天1 h，連續(xù)10 d。造模成功后再隨機分為模型組、得舒特組和四神丸高、中、低劑量組，每組10只。

1.5 給藥方法

模型組灌胃純凈水，得舒特組灌胃成人等效劑量（15.23 mg/kg）的得舒特藥液，四神丸高、中、低劑量組灌胃成人等效劑量4、2、1倍劑量（7.32、3.66、1.83 mg/kg）的四神丸藥液，灌胃體積量均為10 mL/kg，灌胃14 d，正常組常規(guī)飼養(yǎng)。

1.6 標本采集與檢測

最后1次灌胃后水合氯醛麻醉大鼠，冰盒上剖開腹腔，剪取脊椎，其中一小段剝離出脊髓，用生理鹽水漂洗后裝入凍存管中置-80℃冰箱中保存，另一小段放入多聚甲醛中固定后脫鈣。

1.6.1 免疫組化法檢測脊髓組織Ghrelin、GHSR的陽性表達 每組隨機取出5個標本，0TC包埋，冰凍切片機連續(xù)切片。切片放入3% H2O2去離子水孵育10 min，PBS洗3次；滴加100 μL正常山羊血清室溫孵育15 min；加入Ghrelin、GHSR抗體，之后按SP-9000免疫組化染色試劑盒說明書加入SP-9000二抗工作液、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液后AEC顯色、貼片、封片。顯微鏡下拍攝200倍圖像，選取400倍鏡下陽性表達不重復(fù)的5個視野拍片，計算免疫陽性細胞的平均數(shù)。

1.6.2 RT-PCR檢測脊髓組織Ghrelin、GHSR的mRNA表達 每組隨機取出3個標本，根據(jù)RT-PCR的操作方法進行3復(fù)孔操作。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如下：Ghrelin-F：GGTGTCTTCAGCGACTATCT，Ghrelin-R：TGGTGGCTTCTTGGATT，擴增片段大小133 bp；GHSR-F：CTACGCCACGGTCCTCA，GHSR-R：CTTCACGCGGCCCTTA，擴增片段大小103bp；β-Actin-F：CGTTGACATCCGTAAAGAC，β-Actin-R：TAGGAGCCAGGGCAGTA，擴增片段大小110 bp。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR陽性表達的比較

見表1，圖1～圖2。Ghrelin、GHSR在正常組有少量表達，主要集中于脊髓H形的灰質(zhì)中，陽性細胞呈紅褐色，以點狀和條索狀多見。模型組Ghrelin、GHSR陽性細胞數(shù)較正常組顯著增多（P＜0.01）；與模型組比較，四神丸高、中、低劑量組和得舒特組Ghrelin、GHSR陽性表達均減少（P＜0.05或P＜0.01）；且對Ghrelin表達的影響，四神丸高劑量組和得舒特組優(yōu)于低劑量組（P＜0.05），四神丸高、中劑量組與得舒特組比較差異不顯著（P＞0.05）；而對GHSR表達的影響，四神丸高劑量組優(yōu)于低劑量組（P＜0.05），而四神丸中、低劑量組與得舒特組比較，差異不顯著（P＞0.05）。

表1 各組大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR陽性細胞數(shù)比較（個/mm2，±s）

表1 各組大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR陽性細胞數(shù)比較（個/mm2，±s）

與正常組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與四神丸低劑量組比較，*P＜0.05。下同

組別正常組模型組得舒特組四神丸高劑量組四神丸中劑量組四神丸低劑量組n 5 5 5 5 5 5 Ghrelin 6.41±2.94 16.27±4.36#11.16±3.50△*10.78±3.17△△*12.29±3.68△14.04±4.12△GHSR 4.27±1.83 9.07±2.42#6.85±2.37△5.20±1.96△△*6.49±2.31△7.30±2.68△

圖1 各組脊髓Ghrelin陽性細胞表達（AEC顯色，200倍）

圖2 各組脊髓GHSR陽性細胞表達（AEC顯色，200倍）

2.2 各組大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR mRNA表達比較

見表2。模型組脊髓Ghrelin、GHSR mRNA表達較正常組明顯增高（P＜0.01）；四神丸高、中劑量組均能下調(diào)脊髓Ghrelin、GHSR的mRNA表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但與低劑量組和得舒特組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR mRNA表達比較（±s）

表2 各組大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR mRNA表達比較（±s）

組別正常組模型組得舒特組四神丸高劑量組四神丸中劑量組四神丸低劑量組n 3 3 3 3 3 3 Ghrelin 1.17±0.27 1.52±0.30#1.40±0.31 1.33±0.21△1.38±0.25△1.42±0.30 GHSR 1.04±0.16 1.33±0.28#1.22±0.23 1.16±0.20△1.19±0.19△1.24±0.25

3 討論

腦腸軸調(diào)控障礙在IBS-D的發(fā)病中起著非常重要的作用，通過兼具神經(jīng)遞質(zhì)與內(nèi)分泌激素雙重身份的腦腸肽在外周和中樞水平形成一個協(xié)調(diào)統(tǒng)一的整體，調(diào)節(jié)著胃腸運動、感覺、分泌等復(fù)雜功能［7-8］。正是基于以上認知，2016年5月羅馬Ⅳ標準將包括IBS-D在內(nèi)的功能性胃腸病，重新定義為腦-腸互動異常。Ghrelin在胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有分布。Ghrelin的受體GHSR主要分布于下丘腦、胃腸道平滑肌組織和神經(jīng)叢，另外在迷走神經(jīng)和脊髓亦發(fā)現(xiàn)有GHSR的存在［9］。Ghrelin可劑量依賴性地促進大鼠小腸轉(zhuǎn)運，可通過中樞和外周機制促進胃腸運動［10］。研究發(fā)現(xiàn)，功能性胃腸病肝郁脾虛模型大鼠Ghrelin蛋白在下丘腦、脊髓、胃竇和結(jié)腸部位表達下降，胃排空及小腸推進明顯減慢［11］。肝郁脾虛型功能性消化不良大鼠脊髓組織中的Ghrelin蛋白表達也明顯低于空白組［12］。IBS-D模型大鼠血清Ghrelin水平顯著升高［4］。小鼠胃排空的延遲與GHSR的缺乏有關(guān)［13］。

IBS-D屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”范疇，病位在腸，脾失健運是其發(fā)病關(guān)鍵，同時與腎臟關(guān)系密切，后世明確提出了脾腎陽虛的五更泄瀉。有學(xué)者通過研究泄瀉的中醫(yī)證型及其證候分布規(guī)律發(fā)現(xiàn)，脾腎陽虛證在泄瀉中的證型比例為9.21%［14］?；凇捌⒛I相關(guān)”理論，治當益火補土?！秲?nèi)科摘要》所載四神丸為治療脾腎陽虛泄瀉的經(jīng)典名方劑，諸多研究證實，其臨床用于治療IBS-D效果顯著，Meta分析結(jié)果也表明，四神丸治療IBS-D臨床有效率優(yōu)于西藥組，且四神丸安全性更高［15］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，四神丸對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠的作用機制可能與調(diào)節(jié)腦腸肽Ghrelin信號通路指標的表達有關(guān)［16］，可明顯改善模型大鼠血清Ghrelin水平，及其在下丘腦、胃腸中的表達［17-19］。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR的陽性細胞數(shù)均較正常組顯著增多，Ghrelin、GHSR的mRNA表達也均較正常組顯著升高，說明脾腎陽虛泄瀉大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)了Ghrelin及其受體表達水平的紊亂。經(jīng)給藥治療后，四神丸高、中、低劑量均能下調(diào)脊髓Ghrelin、GHSR的陽性細胞數(shù)，四神丸高、中劑量均能下調(diào)脊髓Ghrelin、GHSR的mRNA表達，說明四神丸下調(diào)模型大鼠脊髓Ghrelin、GHSR的表達具有劑量依賴性。以上研究結(jié)果提示，四神丸對脾腎陽虛型泄瀉大鼠的作用與降低脊髓中Ghrelin、GHSR的表達有關(guān)，這可能是其治療脾腎陽虛型泄瀉的中樞作用機制之一。