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      α-硫辛酸在衰老大鼠聽皮層線粒體氧化損傷中的作用

      2020-11-10 13:05:38易志富龔鑫楊雙丹
      中華耳科學(xué)雜志 2020年5期
      關(guān)鍵詞:硫辛酸半乳糖活性氧

      易志富龔鑫 楊雙丹

      廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科(廣州510120)

      聽皮層位于聽覺中樞通路的終端,是聽覺感知的最高級中樞。老年性聾又稱為年齡相關(guān)性聽力損失(age-related hearing loss,AHL),是導(dǎo)致老年人交流障礙的常見原因,在臨床上尚無特效藥物治療。隨著老齡化的到來,老年性聾患者數(shù)量將會大量增長[1,2],研究老年性聾的病因及治療手段變得愈為緊迫。

      本研究利用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)誘導(dǎo)的衰老大鼠模型[3-5],實驗觀察氧自由基清除劑α-硫辛酸(α-lipoic acid,α-LA)[6-8]對衰老大鼠聽皮層線粒體氧化損傷及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響,從而探究α-硫辛酸治療中樞性老年性聾的可行性。

      1 材料和方法

      1.1 實驗動物

      清潔級48只4周齡雄性SD大鼠,體重61g~75g,由廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物室環(huán)境:室內(nèi)相對溫度(23±1)℃,相對濕度(50±10)%。所有動物處死時均無中耳炎。所有實驗動物隨機分為3組(n=16):① 對照組(NS):腹腔注射生理鹽水500mg.(kg.d)-18周后,腹腔注射生理鹽水40mg.(kg.d)-18周;② 衰老組(D-gal):腹腔注射D-半乳糖500mg.(kg.d)-18周后,腹腔注射生理鹽水40mg.(kg.d)-18周;③ 干預(yù)組(α-LA):腹腔注射D-半乳糖500mg.(kg.d)-18周后,腹腔注射α-硫辛酸40mg.(kg.d)-18周。實驗大鼠麻醉方式:肌肉注射氯胺酮(30mg/kg)和氯丙嗪(15mg/kg)麻醉。

      1.2 材料與試劑

      D-半乳糖購自美國sigma公司,8-OHdG購自美國Abcam公司。H2O2、T-SOD、ATP、MMP檢測試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

      1.3 電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)

      各實驗組選取4只大鼠,麻醉后經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水,沖凈血液后斷頭處死,取出顳葉聽皮層組織,2.5%戊二醛下固定至少2h。0.1M PBS清洗20min×4次,使用1%鋨酸后固定2 h,0.1M PBS清洗15min×5次。聽皮層組織行梯度脫水。浸入丙酮對半稀釋的低黏度包埋劑2h,再用低黏度包埋劑37℃烤箱滲透2h。于低黏度包埋劑中70℃烤箱內(nèi)包埋8h。進行修塊,確保上下面平行,行超薄切片。枸櫞酸鉛與醋酸雙氧鈾雙重染色,電鏡下觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu),拍照記錄。

      1.4 線粒體功能指標檢測

      各實驗組選取4只大鼠,快速分離雙側(cè)顳葉聽皮層組織,加入裂解液,冰上勻漿。裂解后4℃12000g離心5min,取上清,用于ATP含量測定。用ATP檢測試劑盒測定ATP含量。用組織線粒體分離試劑盒直接提取顳葉聽皮層組織的線粒體,并采用MMP檢測試劑盒測定MMP水平。

      1.5 免疫組化分析

      用免疫組織化學(xué)方法分析了DNA氧化損傷的生物標志物8-羥基脫氧鳥苷。16只大鼠(每組4只)的大腦在4℃下用4%多聚甲醛緩沖液固定過夜,脫水,最后包埋在石蠟中。依冠狀位切片,厚度約5μm。在二甲苯中脫蠟后,通過梯度濃度的乙醇進行再脫水。脫水后,加入COX IV(1:100稀釋)與8-OHdG(1:200稀釋)一抗4℃過夜。次日用PBS沖洗3次,每次3min;加入羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG二抗(稀釋1:500)室溫下孵育1h。繼而PBS沖洗3次,每次3min,用DAPI染色液復(fù)染細胞核。拍照采圖。

      1.6 抗氧化指標檢測

      對12只大鼠(每組4只)的雙側(cè)顳葉聽皮層組織進行快速分離,加入裂解液,冰上勻漿。裂解后4℃12000g離心5分鐘,取上清,用于測定H2O2與T-SOD。H2O2檢測試劑盒測定H2O2含量。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度;配制WST-8/酶工作液,加入反應(yīng)啟動工作液,37℃孵育30分鐘,在450nm波長處測定吸光度,T-SOD檢測試劑盒測定T-SOD活性水平。

      1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

      由SPSS16.0軟件行數(shù)據(jù)分析,所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,進行多因素方差分析,確定差異的顯著性。

      2 結(jié)果

      2.1 α-硫辛酸對線粒體結(jié)構(gòu)的影響

      與對照組相比,衰老組聽皮層神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)破壞明顯,線粒體體積腫脹,線粒體嵴消失,基質(zhì)出現(xiàn)透明化,甚至出現(xiàn)空泡,干預(yù)組線粒體的超微結(jié)構(gòu),相較衰老組改善明顯(圖1)。

      圖1 聽皮層神經(jīng)元細胞的超微結(jié)構(gòu)(3000×)。NS:對照組;D-gal:衰老組;α-LA:干預(yù)組。N:細胞核;M:線粒體。標尺=0.5μm。Fig.1 Ultrastructure of neuron cells in auditory cortex(3000×).NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group.N:nuclei;M:mitochondrion.Scale=0.5 μ M.

      2.2 α-硫辛酸對線粒體功能的影響

      對照組、衰老組與D-半乳糖+α-硫辛酸組大鼠聽皮層組織的水平分別為12.80±1.90 nmol/mg protein、6.25±1.53 nmol/mg protein與 8.99±0.42 nmol/mg protein,衰老組顯著低于對照組(F=6.5785,P<0.001),而干預(yù)組顯著高于衰老組(F=3.6731,P=0.017)(圖2A);對照組、衰老組與 干預(yù)組大鼠聽皮層線粒體膜電位水平分別為6.13±1.25、3.41±0.29與5.02±1.38,衰老組顯著低于對照組(F=5.8196,P<0.001),而干預(yù)組顯著高于衰老組(F=3.5402,P=0.022)(圖2B)。

      圖2 (A)各組ATP含量;(B)各組MMP水平。NS:對照組;D-gal:衰老組;α-LA:干預(yù)組。*P<0.05,**P<0.01。n=4。Fig.2 (A)the content of ATP in each group;(B)membrane potential level of mitochondria in each group.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group.*P<0.05,**P<0.01.n=4.

      2.3 α-硫辛酸對DNA氧化損傷的影響

      衰老組聽皮層組織含有大量的8-OHdG,且絕大部分與綠色的線粒體重合,提示8-OHdG的表達主要發(fā)生在線粒體,衰老組顯著高于對照組(F=11.918,P<0.001),而干預(yù)組顯著低于衰老組(F=7.3322,P=0.001)(圖3A、B)。

      圖3 (A)紅色熒光標記8-OHdG,綠色熒光標記線粒體,藍色熒光標記細胞核;(B)8-OHdG的定量分析。NS:對照組;D-gal:衰老組;α-LA:干預(yù)組。標尺=20μm。**P<0.01。n=4。Fig.3 (A)red fluorescence labeled 8-OHdG,green fluorescence labeled mitochondria,blue fluorescence labeled nuclei;(B)quantitative analysis of 8-OHdG.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group.Scale=20μM.**P<0.01.n=4.

      2.4 α-硫辛酸對氧化應(yīng)激水平的影響

      對照組、衰老組與干預(yù)組聽皮層H2O2水平分別為13.09±1.23mmol/g protein、29.70±3.40mmol/g protein和18.60±1.13mmol/g protein,衰老組顯著高于對照組(F=14.407,P<0.001),而干預(yù)組顯著低于衰老組(F=8.9269,P<0.001)(圖4A);對照組、衰老組與干預(yù)組聽皮層組織的T-SOD活性水平分別為 155.02±19.15U/mg protein、69.80±8.76U/mg protein和113.89±10.56U/mg protein,衰老組顯著低于對照組(F=6.0503,P<0.001),而干預(yù)組顯著高于衰老組(F=4.6712,P<0.001)(圖4B)。

      圖4 (A)各組大鼠聽皮層H2O2水平;(B)各組大鼠T-SOD活性水平。NS:對照組;D-gal:衰老組;α-LA:干預(yù)組;**P<0.01;n=4。Fig.4 (A)Levels of H2O2in the auditory cortex of rats in each group;(B)Levels of T-SOD activity in the rats in each groups.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group;**P<0.01;n=4.

      3 討論

      據(jù)報道,D-gal注射可引起全身各系統(tǒng)氧化應(yīng)激和線粒體損傷[3-5],類似于自然衰老大鼠所發(fā)生的改變。因此,D-gal已被用作衰老和抗衰老研究的動物衰老模型[9]。α-LA具有干預(yù)性保護衰老過程中外周聽覺系統(tǒng)氧化損傷的作用[5],但α-LA對衰老過程中中樞聽覺系統(tǒng)氧化損傷的影響尚未有探究。所以我們利用D-gal誘導(dǎo)的衰老模型研究α-LA在衰老大鼠聽皮層線粒體氧化損傷中的作用。

      已有研究表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致老年性聾發(fā)病的重要因素[10-14]。機體活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成與清除失衡,進而導(dǎo)致組織氧化損傷。膜脂質(zhì)、線粒體、蛋白、核基因均可被活性氧簇破壞,繼而損害細胞生理功能。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn):在衰老大鼠聽皮層組織中,具有抗氧化作用的T-SOD顯著下降,且H2O2含量明顯增加,再次表明氧化應(yīng)激增加是導(dǎo)致老年性聾發(fā)病的重要因素。

      氧化應(yīng)激會引起線粒體功能障礙。線粒體在體內(nèi)產(chǎn)生超過90%-95%的ATP,同時產(chǎn)生活性氧簇。隨著老化,機體抗氧化能力減弱,導(dǎo)致機體內(nèi)大分子物質(zhì)遭到破壞,導(dǎo)致凋亡增多[15,16]。在老化大鼠中,外周[3]及中樞聽覺系統(tǒng)[4]出現(xiàn)抗氧化失衡,繼而引起線粒體結(jié)構(gòu)破壞。通過本研究亦發(fā)現(xiàn),與對照組比較,衰老組大鼠聽皮層H2O2含量明顯上升,T-SOD顯著下降,機體抗氧化失衡,表明利用D-半乳糖可導(dǎo)致大鼠聽皮層氧化應(yīng)激增加;衰老組大鼠聽皮層組織中ATP和MMP顯著下降,而DNA氧化損傷標記物8-OHdG在線粒體中的表達顯著上升,表明在D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠聽皮層組織中線粒體功能出現(xiàn)紊亂[4]。這些研究表明氧化應(yīng)激損傷及線粒體功能障礙可能是導(dǎo)致老年性聾發(fā)病的重要因素。

      α-LA是一種強抗氧化劑,兼具脂溶性與水溶性。α-LA具有多種抗氧化功能,可直接清除活性氧,減少炎癥反應(yīng),抑制活性氧自由基產(chǎn)生[17,18]。另外有研究發(fā)現(xiàn),α-硫辛酸能夠緩解線粒體損傷[19]。本研究證實:α-LA可顯著降低聽皮層組織線粒體DNA和氧化損傷水平,增加ATP和MMP水平,改善線粒體功能,保護線粒體超微結(jié)構(gòu)。因此,α-LA具有干預(yù)性保護衰老過程中聽皮層組織氧化損傷的作用。

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