丁 旭，肖云萍，郭佳琦，解宇浩，張嘉琪，聶文營，郝 峰

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院，吉林 吉林 132031；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132031）

2010年末，PATAPOUTIAN教授等［1］發(fā)現(xiàn)了感受機械力刺激并促使鈣離子內(nèi)流的機械壓電通道Fam38A和Fam38B，并命名為Piezo1和Piezo2，之后相關(guān)研究快速成為熱點，這2種通道的生理功能也逐漸清晰。機械壓電通道Piezo在多種哺乳動物內(nèi)皮細胞中均有表達［2］，其中Piezo1能感受牽拉或按壓的機械刺激并引發(fā)細胞外Ca2+內(nèi)流［3］，進而參與一系列非常重要的生理功能。有研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1在血管及淋巴管發(fā)育、血壓和紅細胞體積調(diào)控上起到了重要的作用，抑制Piezo1的表達會導(dǎo)致淋巴管發(fā)育不良和溶血性貧血［4-5］。研究表明，Yoda1，Jedi1和Jedi2雖然可特異性地激活Piezo1通道，但Yoda1作為激活劑激活作用周期長，而Jedi1和Jedi2與Piezo1結(jié)合親和力較低，需要較高濃度的Jedi才能引起激活［6］?，F(xiàn)有的抑制劑Gd3+和釕紅（ruthenium red，RR）均是廣譜鈣離子通道抑制劑［7］，缺乏特異性。

電生理技術(shù)是研究離子通道的金標準，但此法不僅需要特定的儀器設(shè)備，對技術(shù)人員也有很高的要求。有研究者使用放射性離子和陰離子敏感的熒光染料以及化學(xué)發(fā)光的方法篩選激活劑和抑制劑，但需要特殊材料和復(fù)雜技術(shù)，且局限性較強［8-9］，同時，每次實驗均要重新制備樣品，限制了方法的推廣和應(yīng)用。

鈣激活氯離子通道蛋白anoctamin-1（ANO1）作為一種鈣激活氯離子通道（calcium-activated chlo?ride channel，CaCC）能在Ca2+的作用下開放并向胞漿中轉(zhuǎn)運Cl-和I-等鹵素陰離子［10］，但細胞內(nèi)外均含有大量Cl-，細胞內(nèi)Cl-會在一定程度上影響檢測結(jié)果。不同于細胞內(nèi)豐富的Cl-，I-在細胞內(nèi)外含量極低，選用I-進行實驗具有干擾低和易控制的優(yōu)點。黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）可在細胞內(nèi)長久表達，其相對熒光強度高。YFP具有多種突變體，有遇鹵素離子淬滅的特性，不同的突變體對不同的鹵素離子敏感［11］，其中雙突變體YFP-H148Q/I152L對I-具有極高的親和力［12］?；诖嗽?，本研究通過共表達ANO1-增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP，ANO1-EGFP）和YFP-H148Q/I152L的Fischer大鼠甲狀腺（Fischer rat thyroid，F(xiàn)RT）上皮細胞，構(gòu)建可用于研究Piezo1通道生理功能的高通量篩選模型，當(dāng)Piezo1通道被激活時，內(nèi)流的Ca2+引起CaCC開放，細胞外的I-內(nèi)流可以引起YFP-H148Q/I152L淬滅。模型模式圖見圖1。本模型經(jīng)濟，快捷，可敏感地反映細胞內(nèi)鈣信號的變化，為Piezo1通道激活劑、抑制劑的篩選提供更優(yōu)的解決方案，以及為其他Ca2+通道的調(diào)節(jié)劑高通量篩選方法的建立提供新的思路。

Fig.1Model diagram of Piezo1 channel screening model based on calcium-activated chloride channel（CaCC）and yellow fluorescent protein-H148Q/I152L（YFP-H148Q/I152L）.A：Piezo1 channel was not activated and YFP emitted yellow fluorescence.B：Piezo1 channel was activated and the yellow fluorescence from YFP was quenched.

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

FRT細胞由Alan S VERKMAN教授饋贈，本實驗室保存。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（以色列Biological Industries公司）；F-12培養(yǎng)基、Fura-2/AM、Yoda1、Jedi1、Jedi2和離子霉素（ionomycin）（美國Sigma公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000（美國Thermo Fisher公司）；Trizol、新霉素（neomycin）和平陽霉素（博來霉素，bleomycin）（美國Invitrogen公司）；切膠回收試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、全蛋白提取試劑盒和BCA蛋白測定試劑盒（全式金公司）；兔抗大鼠Piezo1和Piezo2多克隆抗體、兔抗大鼠β肌動蛋白單克隆抗體和HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（英國Abcam公司）。

FLUOstar Omega全自動多功能酶標儀（德國BMG公司），倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），CO2培養(yǎng)箱（日本Panasonic公司），PCR儀（美國ABI公司），凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司），Nano?drop 2000（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 RT-PCR檢測FRT細胞Piezo1 mRNA表達

設(shè)計大鼠Piezo1和Piezo2的引物各2對，取生長狀態(tài)良好的FRT細胞株，按TRIzol說明書提取FRT細胞總RNA，Nanodrop2000測量總RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：將RNA模板和試劑盒成分按試劑盒說明書推薦的用量混勻，65℃孵育5 min后冰浴2 min，再加其余組分，在PCR儀中25℃孵育10 min后42℃孵育30 min。使用Nanodrop2000測定合成的cDNA濃度。PCR擴增，葡聚糖凝膠電泳60℃溶膠5 min，過柱純化，得純化的PCR產(chǎn)物。回收后的DNA溶液進行核酸測序。測序工作由上海生工公司完成。使用chro?mas軟件檢查測序峰，并用NCBI-BLAST對比核酸序列與測序結(jié)果。

1.3 Western印跡檢測FRT細胞Piezo1和Piezo2蛋白表達

取生長狀態(tài)良好的FRT細胞，按全蛋白提取試劑盒提取FRT細胞總蛋白，提取完成后使用Nano?drop 2000微量分光光度計在280 nm波長下測定濃度，并計算總蛋白量。加5×上樣緩沖液20 μL，于100℃金屬浴 15 min，13 523×g離心 5 min，取上清。每個孔上樣20 μg總蛋白，恒壓80 V電泳30 min。彩色marker分離后，更換電壓120 V電泳60 min。切膠，轉(zhuǎn)膜，100 V持續(xù)120 min。轉(zhuǎn)好的膜置于5%的脫脂奶粉中進行封閉，于室溫搖床上孵育2 h。TBS洗膜，洗膜完成加入一抗，4℃過夜，回收一抗，PBS洗膜3～4次，再加二抗孵育1 h，一抗和二抗均1∶1000稀釋。洗完膜后，顯色，成像。

1.4 FRT模型細胞構(gòu)建和檢測

1.4.1 共表達ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L的FRT模型細胞構(gòu)建

取已轉(zhuǎn)入ANO1-EGFP/pcDNA3.1的大腸桿菌接入50 mL 2×YT培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，按質(zhì)粒小提取試劑盒說明書裂解細菌提取質(zhì)粒。提取完成后，用Nanodrop 2000檢測質(zhì)粒的濃度和純度，按Lipo?fectamine 3000試劑要求，取濃度500～5000 mg·L-1質(zhì)粒備用。FRT細胞接種至24孔板，細胞密度達到70%～90%，按Lipofectamine 3000說明書在EP管中加入轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒和F-12基本培養(yǎng)液，室溫孵育20 min。孵育前用PBS清洗細胞，去除殘留的血清。每孔加F-12完全培養(yǎng)液450 μL。脂質(zhì)體-質(zhì)?；旌先芤悍跤瓿珊螅靠椎渭?0 μL混合溶液，搖勻后置CO2培養(yǎng)箱37℃孵育48 h，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，表示ANO1-EGFP轉(zhuǎn)染成功。再加入含有平陽霉素的篩選培養(yǎng)基進行篩選。篩選2周后，對得到的細胞株進行有限稀釋，利用倒置熒光顯微鏡觀察，并選取熒光強度較高的細胞，即為表達量高的克隆株。得到高表達的克隆后，擴大培養(yǎng)細胞，并用倒置熒光顯微鏡觀察熒光是否表達于細胞膜上。用同法提取YFP-H148Q/I152L質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染表達ANO1-EGFP的FRT細胞，擴大培養(yǎng)細胞，并用倒置熒光顯微鏡觀察熒光是否表達在細胞胞漿中。

1.4.2 熒光淬滅動力學(xué)實驗鑒定轉(zhuǎn)染ANO1-EGFP和YFP-H148Q/I152L后FRT模型細胞的生物學(xué)功能

將生長狀態(tài)良好的FRT模型細胞鋪于黑壁96孔板中，37℃過夜培養(yǎng)。PBS清洗2遍后，分別在FRT模型細胞中加含ANO1激活劑離子霉素（終濃度為 10 μmol·L-1）的 NaI-PBS 溶液（離子霉素組）和僅加Nal-PBS（PBS組），并應(yīng)用FLUOstar Omega全自動多功能酶標儀動態(tài)檢測相對熒光強度變化（0.2 s檢測1次，共檢測14 s）。原始數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 8.0繪圖，證實ANO1是否具有轉(zhuǎn)運I-的功能以及YFP-H148Q/I152L是否對I-敏感，從而確定FRT模型細胞是否具有生物學(xué)功能。

1.5 模型細胞功能檢測和Z′因子計算

1.5.1 熒光淬滅動力學(xué)實驗檢測模型細胞功能

實驗分為PBS組、Piezo1激活劑和抑制劑組。PBS組僅向FRT模型細胞中加Nal-PBS，激活劑組包括Jedi1組（終濃度為 200 μmol·L-1）、Jedi2 組（終濃度為150 μmol·L-1）和Yoda1組（終濃度為20 μmol·L-1），抑制劑組為Gd3++Yoda1組（Gd3+和Yoda1終濃度均為20 μmol·L-1），激活劑組和抑制劑組均加NaI-PBS。應(yīng)用FLUOstar Omega動態(tài)檢測相對熒光強度，利用自定義的三次方程計算相對熒光強度變化（slope）值［11］，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析證實FRT模型細胞是否可用于Piezo1調(diào)節(jié)劑的篩選。

1.5.2 檢測FRT模型細胞對不同激活劑的濃度效應(yīng)

將生長狀態(tài)良好的FRT模型細胞鋪于黑壁96孔板中，37℃過夜培養(yǎng)。實驗分為PBS組和激活劑組：PBS組僅向FRT模型細胞中加NaI-PBS，激活劑組包括離子霉素、Jedi1、Jedi2和Yoda1組，每組按 0.2，1，5，10，25，50，75，100，200，300，400，500，600，700，800，900和1000 μmol·L-1設(shè)置濃度梯度，激活劑組同時加NaI-PBS，每個濃度重復(fù)3次。記錄各組相對熒光強度動態(tài)變化，并利用自定義的三次方程計算相對熒光強度變化值，GraphPad Prism 8.0軟件繪制濃度依賴曲線。

1.5.3 Fura-2熒光探針法檢測FRT模型細胞Ca2+濃度

FRT模型細胞消化離心后制成細胞懸液，加Fura-2/AM（終濃度為 5 μmol·L-1），37℃孵育30 min，并輕輕振動。采用無鈣鎂PBS緩沖液洗滌細胞1次，以去除細胞外殘留的Fura-2/AM。離心后，加含鈣鎂PBS（Ca2+濃度為 2 μmol·L-1）緩沖液制成細胞懸液。在FLUOstar Omega全自動多功能酶標儀中使用340 nm和380 nm雙激發(fā)源在510 nm處記錄熒光強度，測定時記錄靜息時和加入Yoda1 0.2，1，5，10，25，50，75，100，200，300，400，500，600，700，800，900 和 1000 μmol·L-1的340 nm/380 nm熒光比值，按說明書中的計算方式根據(jù)熒光比值計算Ca2+濃度，結(jié)合FRT模型細胞檢測Yoda1的濃度效應(yīng)分析細胞內(nèi)Ca2+濃度和相對熒光強度變化值的關(guān)系。

1.5.4 Z′因子評估

96孔板的前6列加Yoda1 100 μmol·L-1作為實驗組，后6列加PBS緩沖液作為對照組，檢測相對熒光強度變化值并計算Z′因子值。計算公式如下：Z′=1-3×（|sYoda1|+|sPBS|）/（|xYoda1|-|xPBS|）。式中，s為標準差，x為平均數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，采用GraphPad Prism 8.0進行作圖與統(tǒng)計學(xué)分析，使用單因素方差分析，配對樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FRT細胞中Piezo1 mRNA表達

以FRT細胞的cDNA為模板，應(yīng)用2種Piezo1特異性引物分別擴增出401 bp和479 bp條帶，β肌動蛋白基因在對應(yīng)的泳道出現(xiàn)260 bp條帶，與預(yù)期的目的片段大小相符（圖2A）。2種Piezo2特異性引物均未擴增出條帶（數(shù)據(jù)未顯示）。Piezo1引物設(shè)計如表1。

Fig.2 Piezo1 mRNA expression in FRT cells by RT-PCR.A：the electropherogram of RT-PCR；B：gene sequencing peak map by chromas software；C：gene sequence alignment by NCBI-BLAST.

Piezo1條帶的切膠回收產(chǎn)物測序結(jié)果在chromas軟件上進行分析，測序峰圖如圖2B，測序峰峰型整齊，無重疊峰，豎線位置為內(nèi)含子。所測核苷酸序列在NCBI-BLAST進行比對，與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的Piezo1的基因序列相似性為100%（圖2C）。表明FRT細胞表達Piezo1mRNA。

2.2 FRT細胞中Piezo1蛋白表達

Western印跡結(jié)果顯示，F(xiàn)RT細胞中β肌動蛋白表達清晰，有分子質(zhì)量為287 ku的Piezo1蛋白表達，符合其理論值［13］（如圖3），Piezo2蛋白未出現(xiàn)對應(yīng)條帶。表明FRT細胞表達Piezo1。

Fig.3 Piezo1 protein expression in FRT cells by Western blotting.

2.3 FRT模型細胞的鑒定

熒光顯微鏡見，ANO1-EGFP清晰表達于胞膜上（圖4A），YFP-H148Q/I152清晰表達于胞漿中（圖4B）。離子霉素10 μmol·L-1組熒光淬滅；PBS組熒光不淬滅。表明表達于FRT細胞中的ANO1-EGFP具有I-轉(zhuǎn)運的功能，YFP-H148Q/I152具有I-敏感的特性，證實FRT模型細胞構(gòu)建成功（圖5）。

Fig.4 Transfection of enhanced green fluorescent protein labled anoctamin-1（ANO1-EGFP）（A） and yellow fluorescent protein（YFP）-H148Q/I152L（B）to FRT cell，identification by fluorescence microscope.

2.4 FRT模型細胞篩選Piezo1調(diào)節(jié)劑的功能

FRT模型細胞加入Piezo1的3種激活劑Jedi1，Jedi2和Yoda1后熒光淬滅。Gd3++Yoda1組和PBS組熒光不淬滅（圖6A）。與Yoda1組相比，PBS組和Gd3++Yoda1組slope值顯著降低（P<0.01）（圖6B），說明FRT模型細胞可用于Piezo1調(diào)節(jié)劑的篩選。

Tab.1 Design of Piezo1 primers

Fig.5 Effect of ionomycin 10 μmol·L-1on FRT model cells′relative fluorescence intensity（FI）by FLUO?star Omega.PBS：phosphate buffered saline

2.5 FRT模型細胞檢測不同激活劑的濃度效應(yīng)

FRT模型細胞離子霉素的EC50（μmol·L-1）為7.76±0.53，Yoda1的EC50為17.27±1.21，Jedi1的EC50為200.60±4.46，Jedi2的EC50為158.10±4.65（圖7）。

2.6 FRT模型細胞相對熒光強度變化值與細胞內(nèi)Ca2+濃度關(guān)系

Fig.7 Concentration effect of different activators of ionomycin,Yoda1,Jedi1 and Jedi2 on FRT model cells.All test groups had concentration gradients of 0.2，1，5，10，25，50，75，100，200，300，400，500，600，700，800，900 and 1000 μmol·L-1.±s，n=4.

Fig.8 Relationship between fluorescence quenching slope of FRT model cells and intracellular Ca2+concen?tration.Fura-2/AM 5 μmol·L-1was added to FRT model cells，the 340 nm/380 nm fluorescence ratio was recorded at rest and after adding Yoda1 at concentrations of 0.2，1，5，10，25，50，75，100，200，300，400，500，600，700，800，900 and 1000 μmol·L-1，before the Ca2+concentration was calculated based on the fluorescence ratio（A）；FRT model cells were added with Yoda1 at concentrations of 0.2，1，5，10，25，50，75，100，200，300，400，500，600，700，800，900 and 1000 μmol·L-1，the relative fluorescence intensity changes were recorded，and the slope was calculated（B）；GraphPad Prism 8.0 software was used to discribe the relationship between slope and intracel?lular Ca2+concentration（C）.±s，n=4.

結(jié)果顯示（圖8），隨著Yoda1濃度的升高，Ca2+濃度越高，其濃度與Yoda濃度呈濃度依賴關(guān)系（R2=0.9924，P<0.05）〔圖 8B，EC50為（18.68±1.28）μmol·L-1〕。結(jié)合FRT模型細胞相對熒光強度變化值對Yoda1的濃度效應(yīng)（圖8A），利用GraphPad Prism 8.0軟件做出斜率值與細胞內(nèi)Ca2+濃度關(guān)系（圖8C），F(xiàn)RT模型細胞相對熒光強度變化值與細胞內(nèi)Ca2+濃度呈正相關(guān)，且FRT模型細胞相對熒光強度變化值比細胞內(nèi)Ca2+濃度值信號窗口更大。因此利用FRT模型細胞檢測相對熒光強度變化值可敏感地反映細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。

2.7 FRT模型細胞評估Piezo1調(diào)節(jié)劑Yoda1的Z′因子

經(jīng)軟件分析得Yoda1組的相對熒光強度變化值為85.60±2.21，PBS組的相對熒光強度變化值為6.44±1.55（圖9B），信噪比為13.29∶1，計算得FRT模型細胞Piezo1調(diào)節(jié)劑Yoda1的Z′因子為0.82，大于0.5，表明細胞模型可用于Piezo1調(diào)節(jié)劑的高通量篩選（圖9A）。

Fig.9 Z′factor of Piezo1 modulator Yoda1 evaluated with FRT model cells.Yoda1 100 μmol·L-1was added in the first 6 columns of a 96-well plate，and PBS was added as the control group in the last 6 columns，the slope value was detected（A）and the Z′factor value was calculated.Arrow in A shows magnified 4H；B：statistical chart of Z′factor test results.±s，n=4.＊＊P<0.01，compared with PBS group.

3 討論

通過向FRT細胞共轉(zhuǎn)染ANO1-EGFP和YFPH148Q/I152L，本研究構(gòu)建了可用于Piezo1通道調(diào)節(jié)劑高通量篩選的FRT模型細胞。通過驗證結(jié)果表明，本研究建立的FRT模型細胞可用于篩選Piezo1通道調(diào)節(jié)劑，信噪比為13.29∶1。FRT模型細胞對離子霉素、Yoda1、Jedi1和Jedi2的濃度效應(yīng)EC50（μmol·L-1）分別為7.76±0.53，17.27±1.21，200.60±4.46和158.10±4.65。Fura-2熒光探針實驗證實，F(xiàn)RT模型細胞內(nèi)Ca2+濃度對Piezo1激活劑呈濃度依賴關(guān)系，且Ca2+濃度變化與FRT模型細胞相對熒光強度變化值呈正相關(guān)，由于相對熒光強度變化值可反映離子通道開放情況，且比Ca2+濃度信號窗口更大，因此FRT模型細胞可以敏感反映細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，模型Z′因子高達0.82，符合高通量篩選要求。

由于本模型本質(zhì)上是通過熒光信號反映細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化進而篩選Piezo1，在快速、靈敏的同時存在一定的缺陷，以下因素可能會影響篩選結(jié)果：首先，考慮到FRT細胞可能內(nèi)源性表達的如瞬時受體電位通道、酸敏感型離子通道1a、毒蕈堿型乙酰膽堿受體和嘌呤能受體等其他一些能升高細胞內(nèi)Ca2+的G蛋白偶聯(lián)受體或者通道［14-17］，它們的激活和抑制都會影響到Piezo1通道調(diào)節(jié)劑的篩選。其次，一些對熒光信號有干擾作用的化合物也會嚴重影響篩選結(jié)果。此外，一些極性較高，且作用位點于細胞內(nèi)的化合物，因其不能進入到細胞內(nèi)，故很難通過本模型篩選。但本模型僅作為Piezo1的初篩模型，假陽性結(jié)果可通過后續(xù)實驗分辨真?zhèn)?。盡管本模型存在一些問題，但本模型快速、簡便、經(jīng)濟和穩(wěn)定性好的優(yōu)點，仍可為篩選工作帶來極大的便利。本團隊目前已篩選300余種中藥小分子化合物，尚未發(fā)現(xiàn)高活性的激活劑和抑制劑，下一步擬擴大篩選范圍，如從核酸適配體和天然抗體庫中篩選，以期發(fā)現(xiàn)高效特異的Piezo1調(diào)節(jié)劑。

綜上，本模型是高通量篩選Piezo1通道調(diào)節(jié)劑的優(yōu)秀解決方案。本模型的成功構(gòu)建不僅為后續(xù)Piezo1通道調(diào)節(jié)劑篩選提供了優(yōu)秀的解決方案，為Piezo1調(diào)節(jié)劑的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，同時還為其他鈣離子通道調(diào)節(jié)劑篩選方法的構(gòu)建提供新思路。