張慧超,譚 奎,葛 琳,劉 丹,閆麗麗,劉 文,喬 華,解 軍
(1. 山西醫(yī)科大學(xué)a. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,b. 出生缺陷與細(xì)胞再生山西省重點實驗室,山西太原030001;2. 中國科學(xué)院山西煤炭化學(xué)研究所煤轉(zhuǎn)化國家重點實驗室,山西太原030001)
碳量子點(簡稱碳點,CDs)是一種粒徑約為10 nm的新型碳納米材料,形狀為準(zhǔn)球型[1-2]。研究[3-5]表明,CDs特殊的光學(xué)特性和優(yōu)良的生物學(xué)性能使其在分析檢測、藥物傳輸及生物成像等方面具有良好的發(fā)展前景。近期,陽離子碳點(CCDs)的出現(xiàn)更拓寬了CDs的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍。如Guo等[6]將CDs共摻雜N、S元素后,能得到表面電位為+20.29 mV的CCDs,可作為比率型熒光探針檢測目標(biāo)DNA。Zhou等[7]以海藻酸鈉為碳源,將制得的CCDs用作磷酸化轉(zhuǎn)移生長因子β受體1(PTGF-β1)的載體轉(zhuǎn)染3T6細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于常見的基因載體脂質(zhì)體2000和聚乙烯亞胺(PEI)。
隨著CDs在生物領(lǐng)域應(yīng)用范圍的不斷拓展,它與血漿蛋白的作用研究越來越受到業(yè)界的廣泛關(guān)注[8-10]。在生物材料與蛋白作用的眾多研究方法中,光譜分析法是一種常用且簡便、可靠的分析手段。人體纖維原蛋白(human fibrinogen,hFIB)是一種由肝臟合成的具有凝血功能的可溶性血漿蛋白,分子量為340 ku,含有2 964個氨基酸殘基,等電點為5.5[11]。因為含有72個色氨酸殘基,所以hFIB具有很強的內(nèi)源性熒光,常采用內(nèi)源熒光光譜并輔以圓二色譜進行構(gòu)象變化研究。如蔡建周等[12]采用熒光發(fā)射光譜結(jié)合紫外光譜和圓二色光譜,研究了聚賴氨酸與hFIB的相互作用。Qiao等[13]利用內(nèi)源性和外源性熒光光譜結(jié)合圓二色光譜,考察了陽離子與中性表面活性劑等摩爾復(fù)配體系對hFIB構(gòu)象的影響。總之,采用多光譜聯(lián)用技術(shù)能有效檢測CCDs與hFIB的相互作用,但是相關(guān)研究內(nèi)容鮮有報道。
本文中利用蔗糖和谷氨酸為碳源,PEI為鈍化劑,制備CCDs,并利用透射電子顯微鏡、紅外光譜、X射線光電子能譜、納米激光粒度儀、紫外光譜和熒光光譜等對CCDs進行形貌和結(jié)構(gòu)表征,研究CCDs與hFIB相互作用機理,探討CCDs對hFIB構(gòu)象的影響,以及兩者相互作用的規(guī)律。
主要儀器包括:JEM-2100F型高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM),日本電子株式會社;Varian FTIR-640型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR),美國瓦里安有限公司;Maldi-TOF-MS型質(zhì)譜儀,美國賽默飛世爾科技公司;UV-1200型紫外-可見分光光度計,上海美譜達(dá)儀器公司;ESCALAB 250Xi 型X射線光電子能譜儀(XPS),美國賽默飛世爾科技公司;Cary Eclipse型熒光光譜儀,美國瓦里安有限公司;Zetasizer Nano ZS型納米激光粒度儀,英國馬爾文公司;圓二色光譜儀,法國Bio-Logic公司;AUY120 型電子分析天平,日本島津公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱,北京永光明醫(yī)療儀器公司。
主要試劑包括:hFIB(美國Bio Basic公司)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.4)中,濃度為0.05 μmol/L,4 ℃溫度條件下冷藏,備用;蔗糖、谷氨酸、PEI 2000(Solarbio公司,分析純)。其他試劑均為分析純,實驗用水為超純水。
1.2.1 制備
將蔗糖和谷氨酸按照質(zhì)量比10∶1混合,加入適當(dāng)比例的PEI 2000,用30 mL蒸餾水充分溶解后,轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中,在200 ℃溫度條件下反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后,自然冷卻至室溫,得到黃棕色溶液,取出后超聲振蕩30 min,將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管,在轉(zhuǎn)速為12 000 r/min的條件下離心分離15 min,取上清液,用截留分子量為1 000 u的透析袋透析純化24 h,得CCDs棕黃色溶液,冷凍干燥后制得CCDs棕色固體粉末,在4 ℃溫度條件下貯存,備用。
1.2.2 表征
采用質(zhì)譜儀測得合成CCDs的平均相對分子質(zhì)量為1 000。稱取少量CCDs 粉末,溶于超純水中得到CCDs溶液,于納米激光粒度儀上測定CCDs溶液表面電位。將CCDs溶液滴加于超薄碳膜銅網(wǎng)上,晾干;在加速電壓100 kV時,用TEM觀察CCDs 微觀形貌。取少量CCDs粉末,用溴化鉀(KBr)壓片法制樣,利用紅外光譜儀考察其紅外吸收特征。另取少量CCDs粉末進行XPS能譜測試,考察其表面功能團類型。
利用紫外分光光度計測定CCDs溶液的紫外-可見吸收光譜,以硫酸奎寧為參比,計算CCDs 的熒光量子產(chǎn)率。利用熒光光譜儀,在激發(fā)波長為300~500 nm時,每隔20 nm測定相應(yīng)波長范圍內(nèi)CCDs的熒光發(fā)射光譜。
1.3.1 熒光光譜和同步熒光光譜
準(zhǔn)確移取3.0 mL濃度為0.05 μmol/L的hFIB溶液置于石英比色皿中,采用熒光滴定法,依次滴加CCDs溶液(濃度為0.3 mmol/L),在預(yù)先設(shè)定溫度(熱力學(xué)溫度分別為297、304、310 K)條件下,考察激發(fā)波長為278 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度都為10.0 nm時,體系在發(fā)射波長為300~400 nm時的熒光發(fā)射光譜。設(shè)波長間距Δλ分別為15、60 nm,考察hFIB與CCDs作用的同步熒光光譜。
1.3.2 圓二色光譜
在室溫條件下,以PBS緩沖液(pH=7.4)為空白扣除溶劑吸收峰,掃描CCDs與hFIB混合體系在波長為200~250 nm時的圓二色光譜,設(shè)定掃描速度為60 nm/min。
采用HRTEM觀察CCDs的形貌特征,對其粒徑大小和分布進行統(tǒng)計分析,結(jié)果如圖1所示。利用FTIR對合成的CCDs進行結(jié)構(gòu)表征,如圖2所示。
(a)透射電子顯微鏡圖像
(b)高分辨率透射電子顯微鏡圖像
(c)粒徑分布圖1 陽離子碳點的透射電子顯微鏡圖像和粒徑分布
圖2 陽離子碳點的紅外光譜
(a)XPS全譜(b)C 1s能譜(c)N 1s能譜(d)O 1s能譜圖3 陽離子碳點的X射線光電子能譜(XPS)圖
圖4 陽離子碳點的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜
圖5 陽離子碳點的激發(fā)依賴熒光光譜
Zeta電位測試結(jié)果顯示,CCDs的Zeta電位為+28.7 mV,說明其表面帶正電荷。而hFIB(等電點為5.5)在模擬生理條件(pH=7.4)時帶負(fù)電荷,因此,理論上推測CCDs可以與hFIB通過靜電作用力結(jié)合。
2.2.1 CCDs對hFIB的猝滅機理
hFIB分子中的72個色氨酸殘基賦予其很強的內(nèi)源性熒光,當(dāng)激發(fā)波長為278 nm時,在波長為300~400 nm處能觀察到CCDs有很強的熒光發(fā)射;而CCDs在激發(fā)波長為278 nm時發(fā)射的熒光很弱,因此可利用hFIB的內(nèi)源性熒光變化考察CCDs與hFIB之間的作用規(guī)律。CCDs的濃度不同時hFIB的熒光光譜如圖6所示。從圖中可以看出,當(dāng)激發(fā)波長為278 nm時,hFIB在波長338 nm處有最大發(fā)射峰,而CCDs在這種情況下的熒光很弱(見圖5),不會對體系熒光強度的測量產(chǎn)生影響。隨著CCDs濃度增加,hFIB的最大熒光發(fā)射峰由波長338 nm藍(lán)移至335 nm,并伴隨著熒光強度的逐漸減弱,說明在CCDs的影響下,hFIB表面氨基酸殘基疏水性能減弱,原因可能是其與CCDs的結(jié)合引起本身構(gòu)象發(fā)生變化。
曲線1—12對應(yīng)CCDs的濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 μmol/L。圖6 陽離子碳點(CCDs)對人體纖維原蛋白的熒光猝滅光譜
為了進一步研究CCDs對hFIB的熒光猝滅作用機理,對測定數(shù)據(jù)采用Stern-Volmer動力學(xué)方程進行分析,即
(1)
式中:F0為未加CCDs時hFIB的熒光強度;F為加入CCDs后hFIB的熒光強度;c為CCDs的濃度;KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。
不同濃度的CCDs與 hFIB作用的Stern-Volmer動力學(xué)關(guān)系見圖7。由圖可知: 在熱力學(xué)溫度分別為297、304、310 K,CCDs的濃度為0~2.0 μmol/L時,F(xiàn)0/F與CCDs濃度呈良好的線性關(guān)系,且隨著溫度升高,KSV逐漸減小,說明CCDs對hFIB的熒光猝滅作用不是由擴散和碰撞引起的動態(tài)猝滅,而是生成CCDs與hFIB復(fù)合物的靜態(tài)猝滅[16];當(dāng)CCDs的濃度大于2.0 μmol/L時,Stern-Volmer方程的斜率增大,表明CCDs與hFIB中的色氨酸殘基作用增強,原因可能是hFIB有72個色氨酸殘基,其構(gòu)象的改變(圓二色結(jié)果可證明)會導(dǎo)致包埋的色氨酸殘基裸露出來,增加與外源性物質(zhì)作用的機會。
F0—未加CCDs時hFIB的熒光強度; F—加入CCDs后hFIB的熒光強度。圖7 不同濃度的陽離子碳點(CCDs)與人體纖維原蛋白作用的Stern-Volmer動力學(xué)關(guān)系
利用修正的Stern-Volmer方程可以考察濃度為0~2.0 μmol/L時CCDs與hFIB的結(jié)合常數(shù)Ka,
(2)
式中fa為熒光接近分?jǐn)?shù)。
CCDs與hFIB的結(jié)合常數(shù)Ka計算結(jié)果見表1。在CCDs的濃度為0~2.0 μmol/L的線性范圍內(nèi),CCDs與hFIB的結(jié)合常數(shù)Ka與KSV變化趨勢相同:當(dāng)溫度升高時,結(jié)合常數(shù)Ka減小,說明升高溫度會使CCDs與hFIB形成復(fù)合物(CCDs-hFIB)穩(wěn)定性降低,物質(zhì)間作用的強度減弱,符合靜態(tài)猝滅的特點。
2.2.2 CCDs與hFIB的結(jié)合作用力
小分子和生物大分子間的作用力通常包括范德華力、氫鍵、靜電作用力和疏水作用力等,具體作用力的類型可根據(jù)兩者相互作用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)進行判斷[17]。本文中通過式(3)—(5)計算CCDs與hFIB作用的熱力學(xué)參數(shù),結(jié)果如表1所示。
表1 不同溫度時陽離子碳點(CCDs)與人體纖維原蛋白(hFIB)相互作用的猝滅常數(shù)KSV及相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)
(3)
ΔG=-RTlnKa,
(4)
(5)
式中:ΔG為吉布斯自由能變,kJ/mol;ΔH為焓變, kJ/mol;ΔS為熵變, J/(mol·K);T為反應(yīng)溫度,K;R為氣體摩爾常數(shù)。通過lnKa對1/T作圖,可以得到一條直線,由直線的斜率可以計算出ΔH,由直線的截距可以求出ΔS。
由表1可以看出:CCDs與hFIB結(jié)合時ΔG<0,說明CCDs與hFIB的結(jié)合作用是自發(fā)進行的;由ΔH<0、ΔS>0可知,CCDs與hFIB結(jié)合時的作用力主要是靜電作用力,驗證了2.1節(jié)中CCDs與hFIB以靜電結(jié)合的推測。
2.2.3 CCDs對hFIB構(gòu)象的影響
蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化會引起蛋白質(zhì)動力學(xué)的變化,甚至?xí)?dǎo)致蛋白質(zhì)分子活性的改變和喪失。CCDs對hFIB二級結(jié)構(gòu)的影響可以通過圓二色光譜和同步熒光光譜進行考察[18]。
2.2.3.1 圓二色光譜
圓二色光譜是研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的常用方法之一。圖8所示為CCDs與hFIB作用的圓二色光譜。從圖中可以看出,hFIB在波長為208、222 nm處有2個負(fù)峰,表明hFIB具有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)[19]。當(dāng)加入的CCDs濃度逐漸增大時,hFIB的圓二色光譜橢圓率先減小后增大,但譜線形狀基本不變。這一結(jié)果說明低濃度CCDs(1.0 μmol/L)能引起hFIB的α-折疊程度增強,α-螺旋度由起始的16.5%增加到36.0%;當(dāng)CCDs的濃度大于1.0 μmol/L時,又會使得hFIB分子解螺旋,α-螺旋度由起始的16.5%分別減小到6.80%(CCDs的濃度為2.0 μmol/L)、3.10%(CCDs的濃度為3.0 μmol/L)和-2.38%(CCDs的濃度為5.0 μmol/L),α-螺旋度可參考文獻(xiàn)[20]中的方法計算。由此可知,CCDs的濃度增大時對蛋白的構(gòu)象影響很大,甚至使蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)喪失,因此為了保證蛋白的生理功能,CCDs應(yīng)當(dāng)在較低濃度(<1.0 μmol/L)范圍內(nèi)使用。
曲線1—6對應(yīng)CCDs的濃度分別為0、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 μmol/L。圖8 不同濃度的陽離子碳點(CCDs)與人體纖維原蛋白作用的圓二色光譜
2.2.3.2 同步熒光光譜
同步熒光光譜是蛋白構(gòu)象變化的常用分析方法,能夠反映蛋白質(zhì)分子中酪氨酸(Δλ=15 nm)和色氨酸(Δλ=60 nm)殘基的特征信息。CCDs與hFIB作用的同步熒光光譜如圖9所示。由圖9(a)、(b)可以看出,加入CCDs后,hFIB的酪氨酸發(fā)射峰由波長292 nm藍(lán)移至290 nm,色氨酸殘基的熒光發(fā)射峰從波長279 nm紅移到281 nm,說明CCDs與hFIB 結(jié)合后,hFIB分子的疏水微環(huán)境改變,即酪氨酸殘基周圍的疏水性增強,色氨酸殘基周圍的疏水性減弱,使得該蛋白的構(gòu)象變得較為疏松。同時,hFIB的同步熒光峰強度都呈現(xiàn)逐步減小的趨勢,但減小的幅度不同。圖9(c)顯示,在任意相同濃度下,酪氨酸殘基的熒光強度減小幅度顯著低于色氨酸殘基的,說明CCDs與hFIB的色氨酸殘基作用更強,對其影響更大。同步熒光猝滅率RSFQ為
曲線1—12對應(yīng)CCDs的濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 μmol/L。(a)酪氨酸殘基
曲線1—12對應(yīng)CCDs的濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 μmol/L。(b)色氨酸殘基
(c)同步熒光猝滅率圖9 不同濃度的陽離子碳點(CCDs)與人體纖維原蛋白(hFIB)作用的同步熒光光譜
(6)
式中FSF0、FSF分別為不存在、存在不同濃度CCDs時血清蛋白的同步熒光強度。
本文中利用一步水熱法制備了帶正電荷的CCDs,利用熒光猝滅、同步熒光和圓二色光譜考察了CCDs與hFIB的相互作用。CCDs對hFIB產(chǎn)生明顯的熒光猝滅效應(yīng),猝滅機制為靜態(tài)猝滅,兩者之間形成了復(fù)合物。通過計算不同溫度時CCDs與hFIB作用的結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù),可以推斷兩者通過靜電作用力結(jié)合。圓二色光譜和同步熒光光譜結(jié)果表明,CCDs的加入改變了hFIB的二級結(jié)構(gòu),使其α-螺旋結(jié)構(gòu)含量先增大后減小,說明CCDs濃度大于1.0 μmol/L時會對蛋白產(chǎn)生變性作用,具有一定的血液毒性。本文中的研究結(jié)果對CCDs在生物成像及載藥性能方面的應(yīng)用具有參考價值。