張斌，唐滿生*

銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的全基因組學鑒定及表達模式分析

張斌1,2，唐滿生1,2*

(1.湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南 永州 425199；2.湖南省銀杏工程技術研究中心，湖南 永州425199)

以銀杏基因組數(shù)據(jù)庫為基礎，通過序列比對，并經(jīng)過鑒定篩選，共獲得112個ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，對其進行生物信息學及表達模式分析。結果顯示：銀杏112個ERF成員在系統(tǒng)進化樹上分為10個亞家族；基因結構分析表明，大部分家族基因結構簡單，僅少量基因含有1～4個內(nèi)含子；基因表達分析顯示，39個基因在雄蕊中表達量較高，20個基因在幼苗中表達量較高，40個基因在胚中表達量較高；部分基因在雄蕊、胚和幼苗中具有相同的表達模式，說明其可能具有類似的功能。

銀杏；基因家族；生物信息學；基因結構；基因表達

轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、響應生物脅迫和非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子通過結合到DNA序列的特定位置來激活或抑制下游基因的表達，間接發(fā)揮作用[1]。目前，在植物中研究較多的轉(zhuǎn)錄因子家族主要包括WRKY、MYB、MADS、AP2/ERF、bZIP、NAC和bHLH等[2-5]。ERF轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中較大的1個家族，屬于AP2/ERF超家族，其家族成員均含有由60～70個氨基酸殘基組成的AP2/ERF保守結構域(由3個β-折疊和1個α-螺旋組成)[6]。根據(jù)氨基酸序列上存在的AP2/ERF結構域的數(shù)量和含有的其他結構域，可將AP2/ERF超家族分為3個亞家族，即ERF、AP2和RAV，其中AP2家族成員包含2個重復的AP2/ERF結構域，RAV家族成員包含1個AP2/ERF結構域和1個B3結構域，ERF家族成員含有1個AP2/ERF結構域[7]。ERF家族轉(zhuǎn)錄因子可通過結合GCC-box順式作用元件，參與一些激素信號途徑(如乙烯、水楊酸和茉莉酸途徑)和植物生長過程[6]；ERF轉(zhuǎn)錄因子也可調(diào)節(jié)種子生長、花的發(fā)育等過程[6]，參與抵抗干旱、鹽、冷凍等非生物脅迫以及生物脅迫[8]，在植物次生代謝產(chǎn)物的合成，尤其是在藥用植物的活性成分生物合成途徑中發(fā)揮重要作用[9]。

銀杏()原產(chǎn)于中國，經(jīng)濟價值較高。董金金等[10]對銀杏MADS-box家族基因進行了系統(tǒng)的分析；馮磊等[11]對銀杏bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子進行了生物信息及表達模式分析；李澤宏等[12]從銀杏中克隆到1個家族基因，并對其表達模式作了分析。但是，關于銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的全基因組學分析和鑒定的研究尚少見報道。本研究從銀杏基因組中鑒定出ERF家族成員，并對基因家族成員的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化關系、基因和蛋白結構、保守結構域以及在不同組織的表達模式進行了分析，旨在為進一步探究銀杏家族基因的功能提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

試驗所使用的銀杏()基因組數(shù)據(jù)以及銀杏雄株開花期的雄蕊、雌株的胚和銀杏幼苗的表達數(shù)據(jù)均從銀杏基因組數(shù)據(jù)庫(http://gigadb. org/dataset/100209)獲取[13]。

1.2　方法

1.2.1銀杏ERF家族成員的查找與篩選

根據(jù)已報道的擬南芥ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員的氨基酸序列[8]在銀杏基因組數(shù)據(jù)庫GigaDB (http://gigadb.org/dataset/100613)中進行檢索，將檢索得到的氨基酸序列在NCBI-CDD (https://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線數(shù)據(jù)庫中進行保守結構域的預測，去除不含有ERF轉(zhuǎn)錄因子的家族保守結構域或結構域不完整的序列，得到具有完整保守結構域的序列，認定為銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，用于生物信息學分析。

1.2.2銀杏ERF家族理化性質(zhì)及進化樹的構建

使用在線數(shù)據(jù)庫ExPASy分析銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員的理化性質(zhì)，如分子質(zhì)量、等電點和不穩(wěn)定系數(shù)。參考已有報道[8]，從TAIR數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)下載擬南芥ERF家族成員的氨基酸序列。利用Clustal X對擬南芥和銀杏ERF家族成員的氨基酸序列進行多重比對后存儲為FASTA格式文件，采用鄰接法(NJ)繪制系統(tǒng)進化樹[14]。

1.2.3保守結構域、保守基序及基因結構分析

根據(jù)ERF家族氨基酸序列在NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫中的預測結果，導出各個成員的AP2/ERF保守結構域氨基酸序列，利用Clustal X對氨基酸序列進行比對，結合在線工具WebLogo(http://weblogo.berkeley. edu/logo.cgi)分析銀杏ERF家族AP2/ERF結構域中不同氨基酸殘基的保守性[15]。使用在線工具GSDS (Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu. cn/index.php)繪制ERF編碼基因結構圖，分析不同基因所含有的外顯子、內(nèi)含子數(shù)量。運用MEME在線工具(http://meme-suite.org/)分析氨基酸序列包含的保守基序(Motif)[16]。

1.2.4銀杏家族基因的表達

從銀杏基因組數(shù)據(jù)庫中下載銀杏基因表達數(shù)據(jù)，即FPKM值，篩選出銀杏ERF家族成員的FPKM值，進行Z標準化處理，在Heml 1.0軟件中繪制基因的表達熱圖[17]。根據(jù)表達熱圖，分析家族基因在銀杏雄株開花期的雄蕊、雌株的胚和銀杏幼苗中的表達情況。

2　結果與分析

2.1　銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)進化分析

根據(jù)已知的擬南芥ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員的氨基酸序列，在銀杏數(shù)據(jù)庫中檢索到147條可能為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員的氨基酸序列。進一步采用NCBI-CDD在線工具對氨基酸序列上的保守結構域進行檢測，剔除保守結構域中不完整的序列，最終得到112個銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員。根據(jù)下載得到的121個擬南芥ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員的氨基酸序列，運用MEGA 7.0繪制系統(tǒng)進化樹；參考擬南芥ERF家族中的亞家族分類方法[8]，將銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子家族分為10個亞族(圖1)。其中，第Ⅱ和第Ⅲ亞家族中包含的ERF轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多，均為20個；在第Ⅴ、第Ⅵ和第Ⅹ亞家族中包含的家族成員數(shù)量較少，第Ⅴ家族僅包含Gb 03368和Gb 31312，第Ⅵ亞家族包含Gb 10817、Gb 36136、Gb 06377、Gb 27883和Gb 06312，第Ⅹ亞家族中包含有4個成員Gb 32532、Gb 12965、Gb 12588和Gb 16683。在擬南芥中，ERF家族的第Ⅴ、第Ⅵ和第Ⅹ亞家族成員數(shù)量也較少，說明ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物中相對保守?？赏ㄟ^分析銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥ERF成員的進化關系，推測其功能，為深入研究ERF編碼基因在銀杏中的功能提供線索。

圖1　銀杏ERF家族的系統(tǒng)進化分析結果

2.2　銀杏ERF家族成員的理化性質(zhì)

利用ExPASy在線工具對銀杏ERF家族蛋白的理化性質(zhì)進行了分析。銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員所含的氨基酸殘基數(shù)為140~730，平均為343；在整個家族中Gb 24891具有最大的相對分子質(zhì)量(83.17)，Gb 37057的相對分子質(zhì)量最小，為15.54，銀杏ERF家族平均相對分子質(zhì)量為38.16。銀杏ERF第Ⅱ和第Ⅲ亞族成員的相對分子質(zhì)量較低，平均相對分子質(zhì)量分別為24.19和29.93；而第Ⅵ和第Ⅹ亞家族成員的平均相對分子質(zhì)量較高，分別為54.25和57.83。預測得到的理論等電點為4.54~10.50，等電點大于7的銀杏ERF成員僅有34個(占30.4%)，其余78個(占69.6%)轉(zhuǎn)錄因子的等電點均小于7，說明大部分的ERF蛋白質(zhì)分子中含有較高比例的酸性氨基酸。通過對蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)進行分析，絕大多數(shù)的銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；僅有5個ERF家族成員(Gb 17212、Gb 19320、Gb 17211、Gb 35015和Gb 24048)的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，預測為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3　銀杏ERF蛋白的保守結構域分析

利用Clustal X對銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員的氨基酸序列進行多重比對，發(fā)現(xiàn)112個成員中均含有1個由60～70個氨基酸殘基組成的保守區(qū)域，即AP2/ERF結構域，在其N端含有3個β-折疊，C端含有1個α-螺旋(圖2-A)。利用在線工具WebLogo分析銀杏ERF家族所有成員AP2/ERF結構域中氨基酸殘基的保守性，結果如圖2-B所示。G-10(Gly-10)、R-12(Arg-12)、R-14(Arg-14)、G-17(Gly-17)、E-22(Glu-22)、W-34(Trp-34)、G-36(Gly-36)和A-45(Ala-45)等8個氨基酸殘基在銀杏ERF家族中完全保守，推測這些位點可能在ERF家族蛋白功能中起重要作用；W-16(Trp-16)、R-24(Arg-24)、R-36(Arg-36)、L-35(Leu-35)、T-40(Thr-40)、A-44(Ala-44)、A-47(Ala-47)、V-48(Val-48)、D-49(Asp-49)、A-51(Ala-51)和G-57(Gly-57)等11個氨基酸殘基位點在90%以上的ERF保守結構域中均存在，說明ERF家族成員具有保守性。

A為AP2/ERF保守結構域氨基酸序列的多重比對結果；B為利用AP2/ERF保守結構域氨基酸序列生成的WebLogo分析結果。

2.4　銀杏ERF家族基因的基因結構分析

利用在線工具GSDS對銀杏ERF家族112個成員的基因結構進行了分析，結果如圖3所示。大部分的基因不含有內(nèi)含子，有19個基因成員含有1個內(nèi)含子，4個基因成員含有2個內(nèi)含子，5個基因含有3個內(nèi)含子，僅有2個基因含有4個內(nèi)含子。其中，含有3個內(nèi)含子的基因主要分布在第IV、VII、VIII亞家族中，含有4個內(nèi)含子的2個ERF家族成員Gb 10817、Gb 12965分別屬于第VI、第X亞家族。通過分析不同亞家族的基因長度，發(fā)現(xiàn)第II和第III亞家族中的大部分基因長度相近，但短于其他家族成員的基因長度。

I，Ⅱ，…，X分別表示銀杏ERF家族的10個亞家族，粗線部分代表外顯子。

2.5　銀杏ERF編碼基因的表達分析

利用Heml 1.0軟件繪制基因表達熱圖(圖4)。結果顯示：112個銀杏家族基因在不同的組織中表達水平存在差異，39個基因成員在銀杏雄株開花期的雄蕊中的表達水平較高；20個基因在銀杏幼苗中的表達水平較高；40個基因在銀杏雌株的胚中表達量較高；剩余的13個家族基因在3個不同組織中的表達水平一致，且總體表達量較低?；虮磉_的組織差異性，說明不同的家族基因具有不同的生物學功能。有部分基因表現(xiàn)出類似的組織表達模式，如和的表達水平在雄蕊、幼苗、胚中依次降低，說明這些基因可能具有類似的生物學功能。

圖4　銀杏不同組織ERF編碼基因的表達分析結果

3　結論與討論

本研究利用生物信息學手段，從銀杏全基因組中鑒定出112個ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并對其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化關系、保守結構域及保守氨基酸殘基、基因結構、保守基序以及在不同組織中的表達模式進行了詳細分析。根據(jù)擬南芥ERF家族在進化樹上的分類，可將銀杏ERF家族112個成員分為10個亞家族，與桃[9]、黃瓜[10]、馬鈴薯[12]中ERF家族包含的亞家族數(shù)量一致。進一步對銀杏ERF家族成員AP2/ERF保守結構域中的氨基酸進行多重比對發(fā)現(xiàn)，Gly-10、Arg-12、Arg-14、Gly-17、Glu-22、Trp-34、Gly-36和Ala-45共8個氨基酸殘基是完全保守的。而在擬南芥AP2/ERF結構域上存在7個保守的氨基酸殘基(Gly-4、Arg-6、Glu-16、Trp-28、Leu-29、Gly-30)[8]，在桃中只有3個完全保守的氨基酸殘基(Gly-4、Leu-28和Gly-29)[9]，說明家族基因在不同物種中存在一定的差異。有研究[18-20]表明，內(nèi)含子在植物進化過程中起重要作用，可通過轉(zhuǎn)錄后不同剪切方式產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本，以增強植物的適應性；在植物基因組擴張的初級階段，出現(xiàn)了大量的內(nèi)含子，隨著時間的推移逐漸減少。由此推斷，越高級的植物物種，其基因組中的內(nèi)含子數(shù)量越少。銀杏是著名的活化石森林樹種，起源于2.5億年前，現(xiàn)存的銀杏與2.5億年前的形態(tài)性狀非常相似，說明其在進化中十分保守，這可能是其基因組中內(nèi)含子數(shù)量相對較少的原因。

對銀杏家族基因在不同組織中的表達分析結果表明：39個基因在雄蕊中表達水平較高；20個基因在幼苗中表達水平較高；40個基因在胚中表達水平較高；13個基因在3個不同組織中的表達水平總體較低，并且有部分基因具有相同的表達模式。說明ERF家族基因在功能上有特異性，但同源性較高且表達模式一致的基因可能具有類似的生物學功能。

一般來自不同物種的同源基因可能在功能上是保守的。有研究表明，第Ⅴ亞族擬南芥基因()在桑樹中表達可以提高葉片表面的蠟質(zhì)含量，減少水分的散失，增強耐旱性[21]；而第VIII亞族的擬南芥家族基因在茉莉酸防御反應中起負調(diào)控作用[22]；第IX亞族的和則是抗病基因，參與植物防御反應[23]。由此推斷，與它們在進化樹上關系較近的銀杏家族基因可能具有類似的功能。

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Bioinformatics and expression analysis of ERF transcription factor family in

ZHANG Bin1,2, TANG Mansheng1,2*

(1.College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, Yongzhou, Hunan 425199, China; 2.Hunan Provincial Engineering Research Center for, Yongzhou, Hunan 425199, China)

Based on thegenome database, a total of 112 ERF transcription factor family members were obtained through blast, identification and screening, and bioinformatics and expression pattern analysis were performed. The results showed that 112 ERF members were classified into 10 groups on the phylogenetic tree. Gene structure analysis showed that only a small number of genes contain 1-4 introns. Gene expression analysis showed that 39genes were highly expressed in stamens, and 20 genes were highly expressed in seedlings, and 40 genes were highly expressed in embryos. Some genes have the same expression pattern in stamens, embryos and seedlings, suggesting that they may have similar functions.

;gene family; bioinformatics; gene structure; gene expression

Q943.2；S792.95

A

1007-1032(2020)05-0519-08

張斌，唐滿生．銀杏ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的全基因組學鑒定及表達模式分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2020，46(5)：519-526．

ZHANG B, TANG M S. Bioinformatics and expression analysis of ERF transcription factor family in[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(5): 519-526.

http://xb.hunau.edu.cn

2019-11-04

2019-12-23

湖南省自然科學基金(2019JJ50201)；湖南科技學院重點項目(17XKY012)

張斌(1981—)，男，湖南永州人，博士，講師，主要從事植物發(fā)育生物學研究，zhangbin27104@163.com；*通信作者，唐滿生,高級實驗師，主要從事環(huán)境污染防治研究，manshengtang@sina.com

責任編輯：毛友純

英文編輯：柳正