家蠅3種絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)基因在感染白色念珠菌后的表達(dá)

胡 亞，羅 嫚，魏川川，修江帆，吳建偉*

(1. 畢節(jié)市第一人民醫(yī)院，貴州畢節(jié) 551700; 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004; 3. 畢節(jié)市中醫(yī)院，貴州畢節(jié) 551700; 4. 貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽 550004)

昆蟲的免疫系統(tǒng)主要依賴于黑化作用(李殿香等，2013)、體液免疫及細(xì)胞免疫三者相互作用的免疫應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體受病原體感染后，昆蟲體液免疫啟動脂肪體細(xì)胞合成抗菌肽(裴志花等，2014；Osama等，2014)并分泌到血淋巴中殺死入侵的病原體，不同的病原體通過激活Toll信號通路(Wangetal., 2013；Qianetal., 2014)和IMD信號通路(Lemaitre and Hoffmann, 2007)來控制各類抗菌肽分子的產(chǎn)生，但昆蟲先天免疫系統(tǒng)的抗菌肽表達(dá)等免疫應(yīng)答反應(yīng)，如果過度產(chǎn)生將會對宿主自身造成極大的損傷。因此對激活免疫應(yīng)答的上游信號進(jìn)行精確調(diào)節(jié)至關(guān)重要，而許多昆蟲的免疫應(yīng)答都是由絲氨酸蛋白酶(Serine Protease, SP)級聯(lián)介導(dǎo)(Steven and Peter，2011)。

絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)蛋白家族是一個成員眾多、分布廣泛的蛋白酶抑制劑家族(Singh and Jairajpuri，2014)，Serpin主要是通過使用自殺底物原理特異性地與靶酶形成穩(wěn)定的共價復(fù)合物,導(dǎo)致靶酶失活，終止過度免疫應(yīng)答反應(yīng)，對宿主本身起著免受損傷的作用。其廣泛存在于動物、植物和微生物中(Hibbettsetal., 1999)，迄今已發(fā)現(xiàn)1 500多種Serpins(Lawetal., 2006)，根據(jù)其功能的相似性與序列拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)至少可將其分為20個家族，大多數(shù)是糖蛋白，具有免疫調(diào)節(jié)活性(黃薇和吳坤陸，2010；楊偉克等，2014)。它們能折疊成保守的空間結(jié)構(gòu)，且具有特異的類自殺性底物抑制機(jī)制(Irvingetal.，2000；Rubyetal.，2006；魏川川等，2016)。在動物體中，Serpin是維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，一旦基因平衡失調(diào)即會導(dǎo)致多種疾病，任何影響其活性的因素也會造成嚴(yán)重的病理性疾病(滿初日嘎等，2009; 張兵等，2014; 李冰等，2016)。Serpin可作為調(diào)節(jié)因子參與生理反應(yīng)，可調(diào)節(jié)血液中的多種蛋白酶，調(diào)節(jié)酚氧化酶原活化反應(yīng)，還參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種非特異性免疫應(yīng)答(Krowarschetal.，2003；張?jiān)疲?006；韋雙雙等，2012；Gattoetal.，2013)。鑒于Serpin重要的免疫調(diào)節(jié)和生理功能，其功能研究一直倍受關(guān)注。

家蠅Muscadomestica是重要的媒介昆蟲，并且分布廣泛，隸屬于昆蟲綱雙翅目Diptera蠅科Muscidae家蠅屬M(fèi)usca，具有強(qiáng)大的先天免疫系統(tǒng)及生長代謝調(diào)節(jié)功能(修江帆等，2014；彭傳林等，2015；王宇等，2015；胡亞等，2016)，已日益成為研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)，為深入研究家蠅的先天性免疫防御機(jī)制，本研究通過白色念珠菌Canidiaalbicans刺激家蠅3齡幼蟲，對家蠅中具有潛在免疫調(diào)節(jié)功能的3種Serpin基因的時空表達(dá)模式進(jìn)行研究，旨在為今后研究Serpin基因的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2.1動物材料與菌種

家蠅由貴州醫(yī)科大學(xué)-基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院-病原生物學(xué)教研室保種，傳代繁殖，飼養(yǎng)溫度控制在25～28℃，保持相對濕度在70%～80%，光照周期為12 L ∶12 D；白色念珠菌由貴州醫(yī)科大學(xué)-基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院-病原生物學(xué)教研室保存。

1.2.2主要試劑與儀器

PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit試劑盒、DEPC水、SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)試劑盒、總RNA提取試劑TRIzol Reagent均購自Takara公司；氯仿和異丙醇購自西隴科學(xué)；去RNA酶EP管(美國Axygen公司)；PCR擴(kuò)增儀(德國Eppendorf公司)、微量加樣器(德國Eppendorf公司)、冷凍高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、Milli-Q超純水儀(法國Millipore Pharmacia公司)、核酸定量分析儀(GeneQuant公司)、ABI PRISM 7300 Fast real time PCR System(美國)、顯微超微量注射儀(美國)。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI公布的GAPDH(內(nèi)參基因)基因序列和家蠅Sp2、Sp13、Sp16基因預(yù)測序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列如下(表1)：

表1 實(shí)驗(yàn)引物

1.2.2標(biāo)本制備

以濃度為1×1010CFU/mL的白色念珠菌作為感染源，利用顯微超微量注射儀注射家蠅3齡幼蟲，每頭注射210 nL，設(shè)置為感染組，同時以等體積的PBS緩沖液設(shè)為對照組，收集感染后不同時間點(diǎn)(3、6、12、24、36、48 h)和3、12、24、48 h各時間點(diǎn)的家蠅幼蟲組織(馬氏管、體壁、血淋巴、氣管、唾液腺、脂肪體、中腸)標(biāo)本，存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3提取總RNA及合成cDNA

對所有感染標(biāo)本，利用TRIzol提取總RNA，電泳檢測，運(yùn)用GeneQuant公司核酸定量分析儀測定A260/280(1.8≤A260/280≤2.1)及濃度，以1 μg總RNA為模板合成cDNA第一鏈，置于-80℃待用。

1.2.4熒光定量PCR

取上述家蠅3齡幼蟲感染后不同時間點(diǎn)(3、6、12、24、36、48 h)及3、12、24、48 h各時間點(diǎn)的家蠅幼蟲組織(馬氏管、體壁、血淋巴、氣管、唾液腺、脂肪體、中腸)(感染組及對照組)cDNA(1 ∶10稀釋)為模板，設(shè)GAPDH為內(nèi)參基因，按照Takara SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)試劑盒使用說明，利用ABI PRISM 7300(USA)進(jìn)行qPCR，每個樣品重復(fù)3×3次。反應(yīng)體系為：2×SYBR premix EX Taq II 10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.8 μL、下游引物(10 μmol/L)0.8 μL、ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、cDNA 1.0 μL, RNase Free dH20補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s；60℃ 34 s；40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束確認(rèn)qPCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線。

1.2.5數(shù)據(jù)處理及分析

利用GAPDH作為內(nèi)參照，其拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，感染組樣本中Serpin的△Ct值等于各樣本中Serpin的Ct值減去同樣本中GAPDH的Ct值；以對照組中△Ct值作為校正，得出△△Ct(感染組△Ct-對照組△Ct)值(胡亞等，2016)，按目的基因表達(dá)量=2-△△Ct計(jì)算各感染樣本中Sp2、Sp13、Sp16mRNA的相對表達(dá)量。采用Graphpad prism 6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖，通過方差分析進(jìn)行組間比較，P<0.05時具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 qPCR產(chǎn)物分析

根據(jù)qPCR原理，Ct值(Cycle threshold)表示每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，以Ct值來反映目的基因cDNA起始含量，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小(胡亞等，2016)。結(jié)果顯示，所有樣本中Sp2、Sp13、Sp16cDNA顯示指數(shù)增長，其擴(kuò)增曲線為典型的S型曲線并達(dá)到平臺期，CT值線性范圍為15～30(圖1，圖2，圖3)。在熔解曲線中均可見單一的峰，產(chǎn)物特異性好(圖4，圖5，圖6)。

2.2 感染組與對照組Sp2、Sp13、Sp16 mRNA水平

2.2.1 感染后不同時間點(diǎn)

白色念珠菌感染后，家蠅Sp2、Sp13、Sp16基因在不同時間點(diǎn)均顯現(xiàn)出差異表達(dá)。家蠅Sp2基因在感染后3 h時表達(dá)量最高，其次為48 h和6 h，均具有顯著性差異(P<0.05)，而在感染后12 h、24 h、36 h表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；家蠅Sp13基因在感染后6 h時表達(dá)量最高，而3 h和24 h時其表達(dá)量較對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)，在感染后12 h、36 h、48 h表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；家蠅Sp16基因在感染后48 h時表達(dá)量最高，其次為24 h和6 h，而在感染后36 h時其表達(dá)量較對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)，在感染后3 h和12 h表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖7)。

圖1 Sp2擴(kuò)增曲線 Fig. 1 Amplification of Sp2 注：A，感染后不同時間點(diǎn)；B，感染后3 h不同組織；C，感染后12 h不同組織；D，感染后24 h不同組織；E，感染后48 h不同組織。圖2-圖6同。Note:A，Time post infection；B，Different tissues at 3 h postinfection；C，Different tissues at 12 h postinfection；D，Different tissues at 24 h postinfection；E，Different tissues at 48 h postinfection.Same to Fig.2-6.

圖2 Sp13擴(kuò)增曲線 Fig.2 Amplification of Sp13

圖3 Sp16擴(kuò)增曲線 Fig.3 Amplification of Sp16

圖4 Sp2溶解曲線Fig.4 Melting curve of Sp2

圖5 Sp13溶解曲線Fig.5 Melting curve of Sp13

圖6 Sp16溶解曲線Fig.6 Melting curve of Sp16

圖7 家蠅3種Serpin基因在感染后不同時間點(diǎn)的表達(dá)Fig.7 Expression of three Serpin gene in different time after Canidia albicans infection of Musca domestica 注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001

2.2.2感染后不同組織

通過白色念珠菌刺激家蠅幼蟲，選擇感染后3 h、12 h、24 h、48 h時間點(diǎn)，分析Sp2、Sp13、Sp16基因在各組織(馬氏管、體壁、血淋巴、氣管、唾液腺、脂肪體、中腸)中的表達(dá)情況。家蠅Sp2基因在感染后3 h時，在血淋巴中的表達(dá)量最高，其次是在脂肪體中，均具有顯著性差異(P<0.05)，在馬氏管、氣管和腸道中其表達(dá)量比對照組低，差異具有顯著性(P<0.05)；12 h時，在血淋巴中的表達(dá)量比對照組高，而在馬氏管和唾液腺中其表達(dá)量比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)；24 h時，在脂肪體中的表達(dá)量比對照組低，差異具有顯著性(P<0.01)；48 h時，在血淋巴中呈高表達(dá)，在唾液腺中的表達(dá)比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)(圖8)。家蠅Sp13基因在感染后3 h時，在唾液腺和脂肪體中的表達(dá)量比對照組高，而在馬氏管、體壁、血淋巴和氣管中的表達(dá)量比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.05)；12 h時，在血淋巴中呈高表達(dá)，而在體壁和脂肪體中表達(dá)量比對照組低，均具顯著性差異(P<0.05)；24 h時，在血淋巴、氣管和唾液腺中其表達(dá)量比對照組高，在脂肪體中其表達(dá)量比對照組低，差異均具有顯著性(P<0.05)；48 h時，在馬氏管、血淋巴、氣管和脂肪體中其表達(dá)量比對照組高，而在體壁和唾液腺中其表達(dá)量比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.05)(圖9)。家蠅Sp16基因在感染后3 h時，在馬氏管和氣管中的表達(dá)量比對照組低，差異具有顯著性(P<0.01)；12 h時，在馬氏管和脂肪體中其表達(dá)量比對照組低，差異具有顯著性(P<0.01)；24 h時，其表達(dá)量在馬氏管中比對照組高，在脂肪體中比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)；48 h時，在血淋巴中呈高表達(dá)，而在馬氏管中其表達(dá)量比對照組低，均具有顯著性差異(P<0.01)(圖10)。

圖8 Sp2在感染后不同組織中的表達(dá)Fig.8 Expression of Sp2 in different tissues after Canidia albicans infection注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001

圖9 Sp13在感染后不同組織中的表達(dá)Fig.9 Expression of Sp13 in different tissues after Canidia albicans infection注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001

圖10 Sp16在感染后不同組織中的表達(dá)Fig.10 Expression of Sp16 in different tissues after Canidia albicans infection注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001

3 結(jié)論與討論

家蠅孳生環(huán)境復(fù)雜，是重要的媒介昆蟲，其很少感染病原微生物，這和它自身強(qiáng)大的先天性免疫系統(tǒng)有關(guān)(胡亞等，2016)。而大量研究表明Serpin作為重要的免疫調(diào)控因子在先天性免疫調(diào)控作用中發(fā)揮重要作用，如煙草天蛾ManducasextaSerpin6參與了酚氧化酶原的激活(Zou and Jiang，2005)，家蠶Bombyxmori的Serpin家族中有5個基因已被證實(shí)具有免疫調(diào)節(jié)功能(鄭青亮等，2010；李游山等，2012)，且課題組前期構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析家蠅Serpin基因結(jié)果表明(魏川川等，2016)，果蠅DrosophilaSerpin43Ac基因在機(jī)體發(fā)生過度免疫時，可通過抑制作用阻斷Toll信號通路的信號傳遞，抑制抗菌肽Drosomycin(Jean-Marc and Reichhart，2005)的表達(dá)，進(jìn)而終止過度的免疫反應(yīng)，在機(jī)體抵抗外界微生物感染中起到非常重要的作用(Greenetal.，2000)，它與家蠅Sp13和Sp16基因的親緣關(guān)系最接近。家蠅Sp2與黃粉蟲TenebriomolitorSerpinN48和SerpinN40親緣關(guān)系最近，而SerpinN48和SerpinN40已被證實(shí)為黃粉蟲天然免疫的重要負(fù)調(diào)控因子(Jiangetal.，2009；魏川川等，2016)，這為今后研究家蠅Sp2、Sp13和Sp16基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

本研究利用白色念珠菌刺激家蠅幼蟲，采用qPCR技術(shù)成功檢測了家蠅3種SerpinmRNA在家蠅幼蟲感染后不同時間點(diǎn)及不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，家蠅3種Serpin基因在不同時間點(diǎn)呈現(xiàn)差異表達(dá)，家蠅Sp2基因在感染后3 h時表達(dá)量最高，其次是48 h和6 h，Sp13基因在感染后6 h表達(dá)量最高，而在3 h和24 h時其表達(dá)量比對照組低，Sp16基因在感染后48 h時表達(dá)量最高，其次是24 h和6 h，而36 h時其表達(dá)量比對照組低。以上結(jié)果分析表明，家蠅3齡幼蟲時期是家蠅整個生長發(fā)育過程中生長最快和最活躍的階段，當(dāng)受到病原微生物刺激時，家蠅幼蟲卻能正常生長，推測Serpin基因可能參與了家蠅的個體生長發(fā)育，在抵抗外來微生物免疫防御過程中發(fā)揮著重要的作用，但3種Serpin基因在各時間點(diǎn)的表達(dá)各有差異，推測各Serpin基因之間能夠協(xié)同調(diào)控對外來微生物的免疫反應(yīng)。

家蠅Sp2、Sp13和Sp16基因在家蠅幼蟲不同組織(馬氏管、體壁、血淋巴、氣管、唾液腺、脂肪體、中腸)中均有不同程度的表達(dá)，感染后Sp2和Sp13mRNA的表達(dá)量在血淋巴和脂肪體中普遍比對照組高，Sp13mRNA在3 h和24 h時在唾液腺中的表達(dá)量比對照組高，Sp16mRNA在24 h時，其表達(dá)量在脂肪體中比對照組低；48 h時，在血淋巴中呈高表達(dá)。有研究表明脂肪體和血淋巴是昆蟲的主要免疫器官，參與昆蟲的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)，唾液腺是昆蟲主要的消化器官，能夠分泌多種消化酶，在昆蟲的免疫防御系統(tǒng)中扮演著重要的角色。病原微生物感染家蠅時，通過信號通路調(diào)節(jié)抗菌肽的產(chǎn)生，當(dāng)抗菌肽過度表達(dá)時，各免疫器官在相應(yīng)時間高表達(dá)Serpin，通過其特異的類自殺性底物抑制機(jī)制終止過度免疫應(yīng)答反應(yīng)，使宿主內(nèi)環(huán)境保持平衡，使得家蠅在感染病原體后能夠安然地生長繁殖，說明Sp2、Sp13、Sp16可能在家蠅的免疫防御系統(tǒng)中起著重要作用，同時3種Serpin基因在各組織中不同感染時間呈現(xiàn)出差異性表達(dá)，說明3種Serpin基因之間在家蠅免疫防御過程中有協(xié)同調(diào)節(jié)的可能。

通過qPCR結(jié)果分析，推測家蠅Sp2、Sp13、Sp16基因在免疫防御過程中擔(dān)當(dāng)著重要角色，3種Serpin基因在各時間點(diǎn)不同組織中的表達(dá)各有差異，推測各Serpin基因之間具有協(xié)同調(diào)節(jié)作用，這為今后研究Serpin的生物學(xué)與免疫學(xué)功能打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。