吳斌，馬立平，張眉，姜珊珊，郭霞，張思聰，王升吉

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所／山東省植物病毒學(xué)重點實驗室，山東濟南 250100；2.平度市職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校，山東平度 266752；3.山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東濟南 250100）

玉米粗縮病是玉米生產(chǎn)中的一類重要病害，1949年首次在意大利發(fā)現(xiàn)后［1］，相繼在亞洲、南美洲和歐洲的一些國家發(fā)生［2］。1954年，首次在我國新疆和甘肅地區(qū)發(fā)現(xiàn)，自此在我國各玉米產(chǎn)區(qū)均有不同程度的發(fā)生［3］。玉米粗縮病已報到的病原有4種，分別是水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）［4，5］、南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）［6］、玉米粗縮病毒（Maize rough dwarf virus，MRDV）［7］和里奧夸爾托病毒（Mal de Rio Cuarto virus，MRCV）［8］，山東玉米產(chǎn)區(qū)粗縮病主要病原為RBSDV。

近年來，隨著氣候條件變化、耕作制度和種植品種的改變，玉米粗縮病在黃淮海玉米產(chǎn)區(qū)常年發(fā)生，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)，制約當(dāng)?shù)赜衩桩a(chǎn)業(yè)發(fā)展。除農(nóng)藥防治、加強田間管理和錯期播種，選育和推廣種植抗病品種是防治該病害的重要措施。

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源的、21～25 nt的小分子非編碼RNA，是真核生物基因表達中的一類調(diào)控因子，通過降解mRNA、翻譯抑制或通過改變靶基因的染色體結(jié)構(gòu)和基因組DNA的甲基化程度，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達［9，10］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA調(diào)控靶基因的表達在抵御病毒入侵方面起著非常重要的作用。Wu等［11，12］發(fā)現(xiàn)水稻條紋病毒侵染水稻后，miR168與miR528分別調(diào)控水稻體內(nèi)AGO1和抗壞血酸氧化酶的表達，進而影響對水稻條紋病毒（RSV）的抗性水平。Wang等［13］發(fā)現(xiàn)水稻 Os-MADS23、OsMADS27a和OsMADS57對OsRDR1轉(zhuǎn)錄的抑制作用受miR444負(fù)調(diào)控，從而激活抗病毒RNA沉默途徑。nta-miR6019和nta-miR6020通過影響NB-LRR類抗病基因受體的表達來調(diào)控對煙草花葉病毒（TMV）的抗性［14］。目前有關(guān)玉米粗縮病抗性相關(guān)miRNA研究未見報道。

本研究通過對RBSDV侵染不同抗性玉米品種的葉片和莖稈組織樣品進行miRNA高通量測序，鑒定不同品種中差異表達的miRNAs，并進行靶基因預(yù)測及功能富集分析，旨在篩選出玉米抗RBSDV相關(guān)miRNA，進而為探明玉米抗粗縮病分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

RBSDV毒源，采自山東省濟寧市魚臺縣玉米植株，保存于小麥葉片上；傳毒介體灰飛虱，飼養(yǎng)于健康的小麥苗上；玉米材料為耐病品種農(nóng)大108和感病品種鄭單958。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工接種 RBSDV 參照張愛紅等［15］的方法對不同抗性玉米品種進行RBSDV人工接種。

1.2.2 miRNA測序 待鄭單958發(fā)病后，采集兩個品種接種病毒和未接種病毒處理的同時期同部位的植株葉片和莖稈組織（表1），編號后液氮速凍，干冰保存條件下送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進行miRNA的文庫構(gòu)建和高通量測序。

表1 測序樣品信息

1.2.3 miRNA統(tǒng)計 原始測序數(shù)據(jù)首先去除3′接頭序列和堿基長度小于18 nt的序列，如果序列中有80%A或C或G或T，3N（不一定是連續(xù)的），只有 A、C沒有 G、T，或只有 G、T沒有 A、C，或者是連續(xù)的核苷酸二聚體、三聚體，這些序列均被過濾掉。同時，將測得的序列與mRNA、RFam（包含 rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA等）以及 Repbase數(shù)據(jù)庫進行比對過濾，得到有效序列，去除重復(fù)序列后得到單一原始序列和單一有效序列，統(tǒng)計miRNA的長度分布和堿基偏好性。

1.2.4 miRNA注釋及預(yù)測 將測序得到的miRNA序列與miRBase中的玉米及其近緣物種成熟miRNA和miRNA前體序列進行比對，整合有效序列的基因組比對結(jié)果。對于未注釋到任何信息的序列，運用mireap預(yù)測新的miRNA。

1.2.5 miRNA差異表達分析 對各樣品中miRNA進行表達量的統(tǒng)計，并對兩品種相同組織在接種病毒和未接種病毒處理間進行比對，按照表達量倍數(shù)差異｜log2（fold change）｜＞2、P-value＜0.05篩選差異表達miRNAs。

1.2.6 差異表達miRNA靶基因預(yù)測及富集分析借助Target Finder對差異表達miRNA的靶基因進行預(yù)測，同時通過與Genome、KEGG pathway、Gene Ontology、KOG等生物信息數(shù)據(jù)庫進行比對，進行靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對8個玉米miRNA文庫中測序所得的原始序列、過濾后長度大于18 nt的序列、去除重復(fù)后的miRNA序列數(shù)量進行統(tǒng)計分析，見表2。

表2 miRNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計 （個）

2.2 miRNA的長度分布及堿基偏好性

8個樣品中去重前后的序列長度分布情況見圖1，其豐度主要集中于18～25 nt之間，在24 nt的序列豐度最大。

圖1 miRNA序列的長度分布

miRNA中不同位置具有堿基偏好性，圖2為不同長度的miRNA 5′端首位堿基的出現(xiàn)頻率。結(jié)果表明，長度18～22 nt和25 nt的miRNA 5′端堿基以U居多，長度23 nt和24 nt的miRNA 5′端堿基以A居多。

圖2 miRNA首位堿基偏好性

2.3 miRNA注釋與新miRNA預(yù)測

將測序得到的miRNA序列與miRBase中的玉米及近緣物種基因組進行比對，共獲得150個已知miRNA前體序列、174個單一miRNA序列和474個新miRNA序列（表3）。已知miRNA分屬28個 miRNA家族，其中 miR166、miR169、miR171數(shù)目最多，均含有14個成員，其次是miR156，含有12個成員。

表3 miRNA注釋與新預(yù)測miRNA統(tǒng)計

2.4 miRNA差異表達分析

對各樣品中miRNA進行表達量的統(tǒng)計，并用TPM算法對表達量進行歸一化處理，分別對兩品種相同組織在接種病毒和未接種病毒處理間進行比對，分析miRNA的表達差異性（表4）。結(jié)果表明，兩品種間莖稈組織中表達趨勢相反的miRNA有10個，葉片組織中表達趨勢相反的miRNA有17個（表5、表6）。

表4 差異表達miRNA數(shù)目統(tǒng)計

表5 品種間莖稈組織中差異表達miRNA

2.5 差異表達miRNA靶基因預(yù)測及分析

對差異表達的miRNA借助Target Finder進行靶基因預(yù)測，結(jié)果表明，樣品中所有差異表達的miRNA共預(yù)測到1 870個靶基因，存在1 870個靶基因結(jié)合位點。

靶基因GO富集分析（圖3）表明，差異表達miRNA靶基因的生物過程主要集中在生物轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA復(fù)制等；細(xì)胞組成主要涉及細(xì)胞核內(nèi)過程、質(zhì)膜運輸、細(xì)胞質(zhì)等；分子功能主要涉及DNA結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白結(jié)合等。

表6 品種間葉片組織中差異表達miRNA

圖3 差異表達miRNA的靶序列GO富集分析

靶基因KEGG通路分析（圖4）表明，差異表達miRNA的靶基因主要富集在半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氧化磷酸化、泛素介導(dǎo)的蛋白水解及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、維生素B6代謝、吞噬體等通路。

3 討論與結(jié)論

miRNA具有高度保守性和特定的時空表達特性，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、器官發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆生理、病原物互作等重要過程中具有重要的功能。植物病毒的侵染可誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生大量的miRNA，通過上調(diào)或者下調(diào)等模式，抑制防衛(wèi)反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子或促進防衛(wèi)反應(yīng)中的正調(diào)控因子，進而行使功能，達到提高抗性的目的［16］。

種植抗病品種是防治玉米粗縮病的重要措施。因此，發(fā)掘玉米粗縮病抗性相關(guān)基因、miRNA或ta-siRNA等，分析其功能進而探究抗病機制，可為抗病品種的遺傳改良提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，對確保玉米安全生產(chǎn)具有重要意義。本研究對感染RBSDV不同抗性玉米品種進行了miRNA高通量測序，篩選出與抗性相關(guān)的miRNA，葉片組織中共獲得表達趨勢相反的miRNA 17個，莖稈組織中10個；靶基因GO富集分析和KEGG通路分析表明，差異表達的miRNA多與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白代謝等相關(guān)，分析可能在玉米抗粗縮病中起到調(diào)控作用。

圖4 差異表達miRNA的靶序列KEGG富集分析

miR156存在于多種植物中，參與植物的生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及生物脅迫等多種生物過程，是植物生長發(fā)育中重要的調(diào)控miRNA［17］。研究發(fā)現(xiàn)，在玉米中誘導(dǎo)miR156表達量升高后，玉米的分蘗增加、植株矮化［18］；在水稻中，miR156通過調(diào)控12個靶序列影響對水稻齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）的抗性［19］。miR171、miR166及其靶序列參與生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、脅迫相關(guān)蛋白等的調(diào)控，在玉米生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)等生物過程中發(fā)揮重要的作用［20-22］。miR169家族是各種非生物脅迫和發(fā)育途徑的普遍調(diào)節(jié)因子，參與作物的多種抗逆［23］。下一步，將以這些miRNA為研究對象，明確與玉米粗縮病抗性分化密切相關(guān)的miRNA及其靶基因，分析兩者間的調(diào)控模式，以期闡明該調(diào)控模式的作用機制。