李 闖，趙國(guó)群，李 陽(yáng)，張 輝，馮鳳琴

(1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊050000； 2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州310000)

油脂是食品的重要組成部分，作為機(jī)體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)元素之一，一方面要為機(jī)體提供能量，另一方面發(fā)揮著特殊的健康作用。隨著人們生活水平的提高，過(guò)多攝入油脂導(dǎo)致的肥胖和不良的生活方式已經(jīng)成為了心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素[1]。中長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油三酯(MLCT)是一類結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(SLs)，因其同時(shí)具備中鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸，在為機(jī)體供能的同時(shí)避免了脂肪堆積，從而利于健康，在食品工業(yè)中應(yīng)用越來(lái)越廣[2]。根據(jù)甘油三酯(TAGs)在體內(nèi)代謝的特點(diǎn)，MLM型MLCT位于sn-1,3位的中鏈脂肪酸可以快速水解代謝[3]，具有更好的代謝優(yōu)勢(shì)，一直以來(lái)都是MLCT的主要研究方向。

月桂酸是一種特殊的脂肪酸，在中鏈脂肪酸中其碳鏈最長(zhǎng)，雖然屬于飽和脂肪酸，但不具有心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，月桂酸占脂肪酸50%左右的椰子油具有很好的健康功能，南亞等一些地區(qū)使用椰子油作為主要的食用油脂，其心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)降低[4-5]。除此之外，椰子油還有一些特殊功能，如抑菌、消炎[6-7]，而且在對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡中月桂酸表現(xiàn)出了很好的效果[8]。在MLCT的研究中，月桂酸越來(lái)越受到重視，一方面富含月桂酸的中鏈脂肪酸甘油三酯被引入市場(chǎng)，用于色拉油和烹飪，具有很好的功能優(yōu)勢(shì)，如促進(jìn)心腦血管的健康。另一方面，相較于利用傳統(tǒng)的辛酸和癸酸合成的MLCT，富含月桂酸的MLCT煙點(diǎn)更高，應(yīng)用范圍更廣[9]。這些研究表明，月桂酸作為中鏈脂肪酸合成MLCT具有很好的應(yīng)用前景。人乳脂中有20%左右的棕櫚酸，且主要位于TAGs sn-2位，研究表明sn-2棕櫚酸油脂可以促進(jìn)鈣的吸收，預(yù)防因sn-1,3位棕櫚酸與鈣離子結(jié)合造成的便秘[10-11]。除此之外，sn-2棕櫚酸油脂還可以提高骨骼生長(zhǎng)速度,有利于腸道益生菌群生長(zhǎng)，提高骨礦物質(zhì)含量及密度,促進(jìn)大腦發(fā)育等[12]。所以，LaPLa(La，月桂酸；P，棕櫚酸)型甘油三酯具有很好的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)。雖然椰子油中含有大量月桂酸和部分棕櫚酸，但是分子中同時(shí)含有兩個(gè)月桂酸和一個(gè)棕櫚酸的TAGs含量很低，約為1.51%，并且月桂酸和棕櫚酸并沒(méi)有特定位點(diǎn)[13]。富含LaPLa的MLCT具有典型的代謝和功能優(yōu)勢(shì)，一方面含有較多具有健康功能的中鏈脂肪酸月桂酸，另一方面含有較多的sn-2位棕櫚酸，具有很好的應(yīng)用前景。

國(guó)內(nèi)對(duì)于MLCT的研究相對(duì)較晚，最常用的方法是酶催化中鏈脂肪酸甘油三酯與長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油三酯反應(yīng)的酯交換法。這種方法原料利用率高，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，但合成的目的產(chǎn)物脂肪酸位置特異性差。隨著對(duì)MLM型MLCT的深入研究，酸解法在追求脂肪酸位置特異性方面表現(xiàn)出了更大的優(yōu)勢(shì)。本研究設(shè)計(jì)了一種以月桂酸為?；w合成的新型MLCT，即以sn-1,3位特異性脂肪酶催化月桂酸酸解棕櫚硬脂合成富含LaPLa的MLCT，篩選了脂肪酶，對(duì)合成工藝進(jìn)行了優(yōu)化，檢測(cè)了合成的MLCT理化性質(zhì)，為開(kāi)發(fā)新型功能性MLCT奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

固定化脂肪酶RM IM、 TL IM，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；固定化脂肪酶AO IM，杭州康源食品科技有限公司；58℃棕櫚硬脂(PS)，南京新實(shí)力食品科技有限公司；月桂酸， 阿拉丁公司；脂肪酸甲酯混標(biāo)，美國(guó)Sigma公司；正己烷，氣相色譜純，阿拉丁公司；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GC-2014氣相色譜儀，日本島津；7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫；THZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DSC Q200差示掃描量熱儀，美國(guó)TA公司；BSA224S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；L600-A離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 月桂酸酸解棕櫚硬脂合成MLCT

在100 mL圓底燒瓶中加入一定摩爾比的PS和月桂酸，充入氮?dú)?，蓋上翻口塞，置于一定溫度恒溫水浴振蕩器一段時(shí)間，待反應(yīng)底物混合均勻且呈液態(tài)后，加入一定量的固定化脂肪酶，再次充入氮?dú)獗Ｗo(hù)，蓋上翻口塞，200 r/min條件下反應(yīng)一定時(shí)間，得到產(chǎn)物。每個(gè)試驗(yàn)做3組平行。根據(jù)產(chǎn)物中LaPLa含量對(duì)合成條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2 MLCT的純化

MLCT的純化在潘向昆等[14]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，具體為酸解反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾掉固定化酶，收集混合物料于分液漏斗中，加入混合物料12倍體積的正己烷和5倍體積的95%乙醇，加3滴酚酞試劑混勻，滴加0.5 mol/L KOH溶液并不斷搖晃，直到溶液出現(xiàn)粉紅色且30 s內(nèi)不褪色，振搖1 min，靜置收集正己烷相，重復(fù)操作，合并兩次收集的正己烷相，用飽和NaCl溶液洗滌，旋蒸除去有機(jī)溶劑得較為純凈的MLCT。

1.2.3 脂肪酸組成的測(cè)定

參照GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》以及GB/T 24894—2010《動(dòng)植物油脂 甘三酯分子2-位脂肪酸組分的測(cè)定》進(jìn)行脂肪酸甲酯化和氣相色譜分析。以標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間定性，面積歸一化法定量，確定脂肪酸組成及含量。

GC條件：GC-2014氣相色譜儀；DB-23毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)(美國(guó)安捷倫)；FID檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度300℃；載氣為氮?dú)?；分流?0∶1；進(jìn)樣量1 μL；柱溫程序?yàn)槌跏紲囟?00℃，保持2 min，以10℃/min升至160℃，保持4 min，以10℃/min升至210℃，保持5 min，再以10℃/min升至240℃，保持10 min，整個(gè)分析時(shí)長(zhǎng)35 min。

1.2.4 甘油三酯分析及LaPLa含量測(cè)定

取10 μL樣品兩份，分別加入1 mL正己烷，混勻后過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，進(jìn)氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)和氣相色譜儀檢測(cè)。

對(duì)甘油酯和游離脂肪酸通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用定性并確定其出峰順序。對(duì)比出峰順序，結(jié)合氣相色譜圖，不積分游離脂肪酸峰面積，采用面積歸一化法計(jì)算對(duì)應(yīng)甘油三酯含量。每個(gè)試驗(yàn)做3組平行。LaPLa(參照GB 30604—2015《食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯》，以C40甘油三酯計(jì))含量按下式計(jì)算。

(1)

式中：X為L(zhǎng)aPLa的含量；S1為氣相色譜圖中LaPLa對(duì)應(yīng)的峰面積；S2為氣相色譜圖中所有甘油酯對(duì)應(yīng)的峰面積總和。

GC-MS條件：7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀；DB-1HT色譜柱(15 m×0.25 mm×0.10 μm)(美國(guó)安捷倫)；進(jìn)樣口溫度320℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1；恒流模式，柱流速1 mL/min；柱溫程序?yàn)槌跏紲囟?00℃，以5℃/min升到350℃，保持5 min；EI離子源；離子源溫度300℃；四級(jí)桿溫度200℃；質(zhì)量數(shù)(m/z)掃描范圍33～1 000 u。

GC條件：GC-2014氣相色譜儀；DB-1HT色譜柱(15 m×0.25 mm×0.10 μm)(美國(guó)安捷倫)；進(jìn)樣口溫度320℃；FID檢測(cè)器溫度370℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1；柱壓力200 kPa；柱溫程序?yàn)槌跏紲囟?00℃，以8℃/min升到350℃，保持5.25 min。

1.2.5 結(jié)晶熔融特性分析

用DSC Q200差示掃描量熱儀，參照Korma等[15]的方法測(cè)定甘油三酯的熔融起始溫度和結(jié)晶起始溫度。首先，稱量8～12 mg的樣品置鋁盒并密封。樣品在30℃/min下快速?gòu)氖覝丶訜嶂?0℃，并保持10 min，破壞原有的晶體結(jié)構(gòu)。然后以10℃/min冷卻至-40℃，保溫30 min。最后，以10℃/min加熱至80℃。所有樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.2.6 理化性質(zhì)檢測(cè)

酸價(jià)測(cè)定參照GB 5009.229—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》；過(guò)氧化值測(cè)定參照GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》；碘值測(cè)定參照GB/T 5532—2008《動(dòng)植物油脂 碘值的測(cè)定》。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。使用OriginPro 8.0和GraphPad Prism 6.0進(jìn)行繪圖分析。數(shù)據(jù)表示為“x±s”(n=3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PS脂肪酸組成(見(jiàn)表1)

表1 PS脂肪酸組成 %

PS是從棕櫚油中分提出來(lái)的一種油脂，其特點(diǎn)是含有大量的棕櫚酸和部分油酸，且sn-2位棕櫚酸含量很高，這種特殊的組成結(jié)構(gòu)使其成為合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的很好的天然原料[16-17]。由表1可以看出，PS中脂肪酸種類較少，不含月桂酸，棕櫚酸含量達(dá)到73.71%，sn-2位棕櫚酸含量也達(dá)到了66.83%。這種sn-2位含有大量棕櫚酸的特殊結(jié)構(gòu)，成為合成高含量LaPLa的基礎(chǔ)。

2.2 固定化脂肪酶對(duì)合成LaPLa的影響(見(jiàn)圖1)

原料中使用的是熔點(diǎn)為58℃的棕櫚硬脂，所以將3種酶的反應(yīng)溫度都設(shè)在60℃。由圖1可以看出，3種酶表現(xiàn)出了不同的活力和反應(yīng)程度，即反應(yīng)速率和終產(chǎn)物中LaPLa含量。其中TL IM的活力和反應(yīng)程度最低，LaPLa含量上升速度較慢，在最后反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，其LaPLa含量較低，為(22.51±0.41)%。RM IM和AO IM兩種酶在反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，其LaPLa含量沒(méi)有顯著性差異，分別是(32.78±0.50)%和(32.38±0.30)%，但前者的反應(yīng)時(shí)間(8 h)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于后者(4 h)，AO IM表現(xiàn)出了很高的催化效率。需要注意的是，AO IM隨著反應(yīng)的進(jìn)行，LaPLa含量會(huì)下降，這是因?yàn)橛腥鹿鹚岣视王?LaLaLa)的生成。試驗(yàn)中，當(dāng)LaPLa含量趨于平衡時(shí)，隨著反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，LaLaLa開(kāi)始生成且含量越來(lái)越高，這可能是因?yàn)榉磻?yīng)后期?；w移的影響，以及過(guò)高的月桂酸影響了脂肪酶特異性，這與Zhang等[18]的試驗(yàn)結(jié)果相符合。因此，控制好反應(yīng)時(shí)間，AO IM可以滿足此合成工藝，后續(xù)工藝優(yōu)化選取AO IM 作為生物催化劑。

注：反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度60℃，底物(棕櫚硬脂與月桂酸，下同)摩爾比1∶8，酶載量8%(相對(duì)于底物質(zhì)量，下同)。

2.3 AO IM催化合成MLCT工藝優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)溫度對(duì)合成LaPLa的影響(見(jiàn)圖2)

注：反應(yīng)條件為底物摩爾比1∶8，酶載量4%。

在PS的基礎(chǔ)上，因?yàn)橛性鹿鹚岬拇嬖冢拐麄€(gè)反應(yīng)體系熔點(diǎn)降低，在50℃下也能熔融。溫度一方面會(huì)影響體系的黏度，進(jìn)而影響分子之間的相互作用，另一方面會(huì)影響酶的活力[19]。由圖2可以看出，隨著反應(yīng)溫度從50℃不斷地升高，酶的活力越來(lái)越強(qiáng)，反應(yīng)達(dá)到平衡所用的時(shí)間越來(lái)越短，65℃時(shí)最短，為3 h。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到70℃時(shí)酶的活力下降，反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間延長(zhǎng)，反應(yīng)速率降低。這可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高，使部分酶失活，整體催化能力降低。所以，選擇65℃作為酶催化合成試驗(yàn)的下一步優(yōu)化基礎(chǔ)。

2.3.2 酶載量對(duì)合成LaPLa的影響(見(jiàn)圖3)

注：反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度65℃，底物摩爾比1∶8。

通常情況下，反應(yīng)速率會(huì)隨著酶載量的升高而升高，直到達(dá)到過(guò)載點(diǎn)為止，過(guò)高的酶載量會(huì)促進(jìn)底物擴(kuò)散，繼而抑制酶的活性[20]。由圖3可以看出，隨著酶載量的不斷升高，反應(yīng)速率越來(lái)越快，達(dá)到平衡時(shí)間越來(lái)越短，但是反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)LaPLa含量沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明酶載量對(duì)LaPLa合成速率影響大，對(duì)反應(yīng)程度影響小，即對(duì)終產(chǎn)物含量影響小，這與Araújo等[21]報(bào)道的結(jié)果吻合。12%酶載量合成反應(yīng)最先達(dá)到平衡，1.5 h時(shí)LaPLa含量可達(dá)到(32.43±0.87)%，與10%酶載量合成反應(yīng)1.5 h的結(jié)果((31.19±0.03)%)沒(méi)有顯著性差異，而與8%酶載量合成反應(yīng)1.5 h的結(jié)果((28.76±0.16)%)有顯著性差異。這說(shuō)明，酶載量從10%提高到12%已經(jīng)不能顯著提高反應(yīng)速率，過(guò)高的酶載量使反應(yīng)快速平衡，同時(shí)加快了酰基遷移[22]。另外，考慮到脂肪酶的成本，選擇10%為最適酶載量，作為酶催化合成試驗(yàn)的下一步優(yōu)化基礎(chǔ)。

2.3.3 底物摩爾比及反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成LaPLa的影響(見(jiàn)圖4)

注：反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度65℃，酶載量10%。

由圖4可以看出，隨著底物摩爾比的不斷升高，反應(yīng)平衡時(shí)LaPLa含量越來(lái)越高，反應(yīng)在2.5 h時(shí)基本都達(dá)到了平衡，說(shuō)明底物摩爾比對(duì)LaPLa合成速率影響小，對(duì)終產(chǎn)物含量影響大。底物摩爾比為1∶12時(shí)反應(yīng)2.5 h時(shí)達(dá)到平衡，LaPLa含量為(41.12±0.18)%，反應(yīng)3 h LaPLa含量升高但沒(méi)有顯著性差異。底物摩爾比為1∶10反應(yīng)2.5 h達(dá)到平衡且終產(chǎn)物含量最高，為(40.59±0.29)%，與底物摩爾比1∶12的LaPLa含量相比沒(méi)有顯著性差異，而與底物摩爾比1∶8的相比有顯著性差異，故1∶10是該酶促合成反應(yīng)的底物摩爾比飽和值。同時(shí)，當(dāng)?shù)孜锬柋仍黾拥?∶10和1∶12時(shí)，在反應(yīng)的起始階段反應(yīng)速率較慢，這可能是過(guò)高的底物摩爾比導(dǎo)致pH過(guò)低，影響了酶的活性[23-24]，而隨著反應(yīng)的進(jìn)行反應(yīng)速率又逐漸加快。故底物摩爾比和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果分別為1∶10和2.5 h。

綜上所述，月桂酸酸解棕櫚硬脂合成富含LaPLa的MLCT的最佳條件為：底物摩爾比1∶10，反應(yīng)溫度65℃，酶載量10%，反應(yīng)時(shí)間2.5 h。在最佳條件下，LaPLa的含量為40.59%。

2.4 純化后MLCT脂肪酸和甘油三酯組成

在最佳工藝條件下合成并純化MLCT，測(cè)定其脂肪酸組成，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 純化后MLCT脂肪酸組成 %

由表2可以看出，純化后MLCT月桂酸的摻入率達(dá)到了50%，同時(shí)反應(yīng)中發(fā)生了?；w移，部分月桂酸摻入到了sn-2位。sn-2位棕櫚酸含量有所下降，但仍達(dá)到了59.91%。

反應(yīng)后的混合物經(jīng)脫酸純化后，其甘油三酯組成和含量與純化前基本吻合。純化后LaPLa的含量為(41.64±0.51)%，LaLaLa的含量低于8%，PPP的含量低于1%。

2.5 純化后MLCT的熔融特性(見(jiàn)圖5)

油脂的熔融特性與脂肪酸和甘油三酯的類型有關(guān)，短鏈、中鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸含量高的油脂比長(zhǎng)鏈脂肪酸含量高的油脂熔融溫度低[25]。由圖5A可以看出，MLCT結(jié)晶起始溫度(17.58℃)較PS(42.04℃)低，在14.71℃處觀察到結(jié)晶峰，說(shuō)明MLCT具有更低的結(jié)晶點(diǎn)，這些都與月桂酸的摻入有關(guān)。由圖5B可以看出，MLCT熔融溫度較PS大幅降低，熔融峰從58.24℃降為33.74℃，熔融起始溫度為23.97℃，曲線的基線相對(duì)平滑，這說(shuō)明經(jīng)酶促酸解反應(yīng)后形成了新的甘油三酯分子(MLCT)，且該油脂成分組成相對(duì)單一。熔融峰為33.74℃，低于人體溫度(36～37℃)，這一特性有助于其在嬰幼兒食品中的應(yīng)用，可在體溫下完全融化進(jìn)入人體代謝，有利于消化吸收。

2.6 純化后MLCT的理化性質(zhì)

在最佳工藝條件下合成并純化MLCT，測(cè)定其理化性質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 PS和MLCT理化性質(zhì)

由表3可以看出，合成的MLCT經(jīng)純化后酸價(jià)有所下降，但和PS相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。過(guò)氧化值表示油脂的氧化程度，是衡量油脂品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。MLCT較PS過(guò)氧化值顯著(P<0.05)升高，這可能是因?yàn)樵谠囼?yàn)過(guò)程中高溫和酸性環(huán)境等加快了油脂的氧化，使過(guò)氧化值升高。碘值是衡量油脂不飽和度的指標(biāo)，PS中部分不飽和脂肪酸被月桂酸取代，造成MLCT碘值顯著(P<0.05)低于PS。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)月桂酸酸解PS合成一種結(jié)構(gòu)相對(duì)單一的MLCT，即富含LaPLa的MLCT，優(yōu)化了合成工藝，檢測(cè)了純化后MLCT的理化性質(zhì)。結(jié)果表明：固定化脂肪酶AO IM具有良好的催化性能，在反應(yīng)溫度65℃、酶載量10%、底物摩爾比1∶10、反應(yīng)時(shí)間2.5 h的工藝條件下，LaPLa的含量可達(dá)到40.59%；與PS相比，純化后的MLCT酸價(jià)和碘值有所降低，過(guò)氧化值顯著升高，結(jié)晶起始溫度和熔融起始溫度都有所降低。合成的富含LaPLa的MLCT具有典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即盡可能將月桂酸的功能與MLM型MLCT代謝優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來(lái)，同時(shí)sn-2位保留大量棕櫚酸，有利于在嬰幼兒食品中的應(yīng)用，為新型MLCT的合成提供了研究思路。