徐洪文，朱 瑜，徐 華，孫嘉笛，紀(jì) 劍，孫秀蘭，張 瑤

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122；2.廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣州 510627； 3.漢中市質(zhì)量技術(shù)檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000)

食用植物油因油料作物生長、收獲及油脂精煉、儲存和消費過程中受到異常氣候、儲藏環(huán)境和運輸條件等影響造成的真菌污染而容易產(chǎn)生有害的真菌毒素[1]。食用植物油中常見的真菌毒素有黃曲霉類毒素、單端孢霉烯族類毒素、伏馬類毒素、赭曲霉類毒素等[2-4]。大多數(shù)的真菌毒素具有肝毒性、致畸性、致癌性、腎毒性、出血性、破壞免疫系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等危害[5]，攝入量超過一定限量后，會危害人類及其他生物健康，甚至危害生命[6]。因此，檢測食用植物油中真菌毒素對食品安全監(jiān)管及疾病預(yù)防控制具有重要意義。

目前，食用植物油中真菌毒素的檢測方法主要有薄層層析色譜法[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[13-14]、酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金免疫層析法[15]等。薄層層析色譜法靈敏度低、重現(xiàn)性較差，其應(yīng)用受到一定的限制；酶聯(lián)免疫吸附法半定量篩查檢測，其假陽性率高，不能作為確證實驗；相對來說HPLC方法較為簡便實用，儀器普及易于推廣。

真菌毒素樣品前處理方法主要有液液萃取法、固相萃取法(SPE)、免疫親和層析法、QuEChER法、直接稀釋法、分散液液微萃取法(OLLME)[16-17]。其中，SPE(包括IAC和MFC)是應(yīng)用最廣泛、技術(shù)最成熟的一種前處理方法，但通常SPE操作過程煩瑣、所需時間較長，材料成本較高。目前，這些前處理方法對一種或一類真菌毒素提取效果好，但對食用植物油中多種真菌毒素同步提取的研究較少，因此需要建立一種能夠有效、同步檢測食用植物油中多種真菌毒素的方法。本研究建立了一種能夠同時測定食用植物油中多種真菌毒素的高效液相色譜-熒光檢測分析方法(HPLC-FLD)，在樣品前處理方面，對分散液液微萃取技術(shù)(DLLME)進(jìn)行改進(jìn)和條件優(yōu)化，以增加其在食用植物油中的適用性，為完善食用植物油的真菌毒素檢測和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

5種食用植物油(大豆油、玉米油、菜籽油、花生油以及食用調(diào)和油)共28個樣，市售。黃曲霉毒素B1(AFB1)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、黃曲霉毒素B2(AFB2)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、黃曲霉毒素G1(AFG1)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、黃曲霉毒素G2(AFG2)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、赭曲霉毒素A(OTA)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)、赭曲霉毒素B(OTB)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，購于Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇，色譜純，購于上海國藥集團(tuán)；正己烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸，分析純，購于上海國藥集團(tuán)；甲酸，色譜級，購于阿拉丁公司；三氟乙酸，分析純，購于上海麥克林公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀(熒光檢測器(FLD)，美國Agilent公司；Lab Dancer旋渦儀；SCIENTZ-10LS真空離心濃縮儀；SCIENTZ-10N普通型冷凍干燥機(jī)； Centrifuge 5424 R高速冷凍離心機(jī)，美國Eppendorf公司；SCIENTZ-5200 DTD超聲波清洗機(jī)；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)，美國Millipore公司；DZF-6096真空干燥箱；LC-DCY-24G干式氮吹儀；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm, 3.5 μm)；柱溫40℃；流動相流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；熒光檢測器。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

用甲醇將各標(biāo)準(zhǔn)品配制成一定質(zhì)量濃度的儲備液，分別準(zhǔn)確吸取6種標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇-乙腈(體積比50∶50)稀釋得AFB1、AFB2、AFG1和AFG2質(zhì)量濃度均為1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、50.00 μg/L，OTA和OTB質(zhì)量濃度均為2.00、4.00、10.00、20.00、50.00、100.00 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 樣品前處理

1.2.3.1 樣品提取

參考吳宇等[18]的樣品提取方法。準(zhǔn)確稱取5.0 g(精確至0.01)油樣放入50 mL離心管中，再加入10 mL石油醚，渦旋混勻1 min，加提取液乙腈-水-乙酸(體積比84∶15∶1)10 mL，渦旋1 min后，超聲提取20 min，靜置，室溫下8 000 r/min離心10 min，取下層提取液置于15 mL離心管中，待用。取上述提取液1 mL于10 mL離心管中，加等體積的水，渦旋1 min，靜置，4℃、12 000 r/min下離心10 min，取上清液過膜備用。

1.2.3.2 DLLME步驟

取1 mL三氯甲烷(用作萃取劑)加入1 mL 1.2.3.1 過膜后的提取液(用作分散劑)，充分混勻。將混合物迅速注入裝有5 mL超純水(pH 3)的離心管中，萃取劑、分散劑與水相充分混合，將混合溶液渦旋振蕩1 min，然后6 000 r/min、室溫離心10 min后，將離心管底部三氯甲烷取出，重復(fù)上述操作，反復(fù)萃取3次，萃取液經(jīng)氮氣(40℃，1 mL/min)吹干后，供柱前衍生化。

1.2.3.3 柱前衍生化

在1.2.3.2盛有殘留物的離心管中加入衍生試劑200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，振蕩30 s，40℃烘箱條件下衍生化15 min。衍生化后的溶液經(jīng)氮氣(40℃，1 mL/min)吹干，殘留物用200 μL乙腈復(fù)溶，渦旋混勻后供高效液相色譜儀分離檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

A相選擇甲醇、乙腈，B相選擇0.05%甲酸、0.05%乙酸、0.05%三氟乙酸，設(shè)計6組實驗。根據(jù)6組實驗結(jié)果比較可知，乙腈作為流動相A時，由于具有強(qiáng)洗脫能力使得各組分保留時間較短，分離度較差，而甲醇的洗脫能力較弱，6種真菌毒素都能進(jìn)行基線分離，各組分保留時間適中，同時分別對含相同比例不同酸的水溶液流動相進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)0.05%乙酸作為B相時，OTA和OTB分離度較低，并且目標(biāo)峰的峰形不佳，而0.05%三氟乙酸作為B相時，基線擾動較大，且存在拖尾的現(xiàn)象，選擇0.05%甲酸作為B相時各組分能夠很好地分離，且基線擾動較小，因此選擇甲醇作為A相，0.05%甲酸作為B相時，6種真菌毒素能夠達(dá)到很好的分離效果。為了提高分析檢測效率，縮短檢驗時間，本研究進(jìn)一步考慮采用梯度洗脫，經(jīng)過實驗確定最佳的流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.1.2 檢測波長的選擇

取200 μL質(zhì)量濃度為25 μg/L的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和200 μL質(zhì)量濃度為50 μg/L的 OTA和OTB標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)行各毒素全波長掃描，優(yōu)化確定同步檢測的波長。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2最佳激發(fā)波長360～380 nm，AFB1和AFB2最佳發(fā)射波長450 nm，AFG1和AFG2最佳發(fā)射波長470 nm，確定4種黃曲霉毒素的激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為460 nm；OTA和OTB激發(fā)波長為327 nm，發(fā)射波長為460 nm，有利于提高分析的靈敏度。

2.2 提取過程的優(yōu)化

以下優(yōu)化實驗樣品AFB1、AFB2、AFG1和AFG2加標(biāo)量5 μg/kg、OTA和OTB加標(biāo)量10 μg/kg。

2.2.1 提取液的選擇及比例優(yōu)化

多數(shù)的真菌毒素易溶于甲醇、乙腈等極性有機(jī)溶劑[19]，因此植物油中真菌毒素的提取溶劑一般選用甲醇或乙腈或兩種溶劑的混合溶液。以玉米油為例，本研究考察了甲醇-水-乙酸(體積比84∶15∶1)、甲醇-水-甲酸(體積比84∶15∶1)、乙腈-水-乙酸(體積比84∶15∶1)、乙腈-水-甲酸(體積比84∶15∶1)、甲醇-水(體積比84∶16)、乙腈-水(體積比84∶16)6種常見的提取液對玉米油中6種真菌毒素加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取液對食用植物油中6種真菌毒素加標(biāo)回收率的影響

由圖1可知，乙腈-水-乙酸(體積比84∶15∶1)對食用植物油中6種真菌毒素的加標(biāo)回收率均較好，因此選擇乙腈-水-乙酸(體積比84∶15∶1)作為最佳提取液。然后，進(jìn)一步對乙腈-水-乙酸的比例進(jìn)行了優(yōu)化，真菌毒素加標(biāo)回收率結(jié)果見表2。

表2 提取液比例對食用植物油中6種真菌毒素加標(biāo)回收率的影響

由表2可以看出，當(dāng)采用乙腈-水-乙酸(體積比84∶15∶1)提取時，6種真菌毒素的加標(biāo)回收率在82.25%～92.85%之間，因此實驗采用乙腈-水-乙酸(體積比84∶15∶1)作為油樣中真菌毒素檢測的提取液。

2.2.2 提取方式的選擇

以玉米油為例，考察高速均質(zhì)(12 000 r/min，5 min)、渦旋振蕩(10 min)、超聲(20 min)、搖床(20 min)4種提取方式對玉米油中6種真菌毒素加標(biāo)回收率的影響，以確定最佳的提取方式，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同提取方式對食用植物油中6種真菌毒素加標(biāo)回收率的影響

由圖2可知，超聲提取對食用植物油中6種真菌毒素加標(biāo)回收率均在80%以上，加標(biāo)回收率高于渦旋振蕩、搖床和高速均質(zhì)。對于油樣中真菌毒素的提取，高速均質(zhì)難以操作，且會造成樣品量損失，搖床和渦旋振蕩兩種提取方式效率較低，超聲提取加標(biāo)回收率高，因此本研究選取超聲作為樣品中真菌毒素的提取方式。

2.3 DLLME條件的優(yōu)化

在DLLME萃取過程中，萃取劑種類顯著影響萃取效率，通常要求萃取劑有適合的極性、對待測物有良好的溶解度。因此，以玉米油為例，對幾種不同密度、極性的鹵代烴的萃取效果進(jìn)行了考察，包括CH2Cl2、CHCl3和CCl4。對玉米油進(jìn)行加標(biāo)實驗，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2加標(biāo)量5 μg/kg、OTA和OTB加標(biāo)量10 μg/kg。1.0 mL提取液中加入5.0 mL水(pH 3)和1.0 mL待評估有機(jī)溶劑(萃取劑)，每組實驗設(shè)置3次平行，真菌毒素加標(biāo)回收率結(jié)果如圖3所示。

圖3 DLLME不同萃取劑對食用植物油中6種真菌毒素加標(biāo)回收率的影響

由圖3可知：CCl4作為萃取劑時各真菌毒素的加標(biāo)回收率除OTA高于80%外，其余均低于80%，可不予考慮；盡管CH2Cl2作為萃取劑時AFB2、AFG1、OTB和OTA回收率較高， 但與CHCl3萃取效果比較不顯著，CHCl3作為萃取劑時AFB1、AFG2的加標(biāo)回收率優(yōu)于CH2Cl2的。因此，本實驗采用CHCl3作為DLLME過程的萃取劑。

2.4 柱前衍生化對真菌毒素檢測信號響應(yīng)的影響

對6種混合真菌毒素進(jìn)行柱前衍生化，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2質(zhì)量濃度為25 μg/L，OTA和OTB質(zhì)量濃度為50 μg/L，6種真菌毒素在衍生化前后的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比較見圖4。

由圖4A和圖4B可知，6種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液未進(jìn)行柱前衍生化直接檢測時得到的色譜圖中，AFG2、AFB2、OTA和OTB均有較高的熒光響應(yīng)，而AFG1和AFB1熒光響應(yīng)非常弱，在色譜圖中幾乎看不到二者的色譜峰。由圖4C和圖4D可知，6種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行柱前衍生化后，AFB1和AFG1的熒光信號大幅增強(qiáng)，其他4種真菌毒素的熒光信號除了AFB2有增加外，其余3種沒有明顯變化。AFB1和AFG1在紫外光照射下能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生具有強(qiáng)熒光的產(chǎn)物，從而使熒光信號大幅度的增強(qiáng)，實現(xiàn)10-9級的定量檢測[20]。本實驗利用這一特性，采用柱前衍生化對AFB1和AFG1進(jìn)行處理，從而能對其進(jìn)行有效的測定。

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

用HPLC-FLD在最優(yōu)條件下測定配制的系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表3。

表3 6種真菌毒素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

由表3可知，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2及OTA、OTB分別在1～50 μg/L、2～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2均大于0.999，方法檢出限(以信噪比≥3計)為0.2～0.5 μg/kg，定量限(以信噪比≥10計)為0.6～1.5 μg/kg。

2.6 回收率與精密度

在空白玉米油、空白大豆油、空白菜籽油、空白調(diào)和油、空白花生油樣品中加入高、中、低3個加標(biāo)量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)條件下對加標(biāo)樣品進(jìn)行提取、萃取、衍生化處理等，經(jīng)HPLC-FLD進(jìn)行分析，每個加標(biāo)水平進(jìn)行6次重復(fù)實驗，計算加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見表4。由表4可知，5種油樣中6種真菌毒素3個添加水平下的回收率在75.88%～105.25%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.5%～9.5%之間，說明該方法對AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA和OTB有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表4 5種油樣中6種真菌毒素加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.7 實際樣品的測定

2019年實驗室采用該方法對食品安全風(fēng)險監(jiān)測中28個食用油樣品(包括玉米油、花生油、大豆油、菜籽油和調(diào)和油)進(jìn)行6種真菌毒素測定，結(jié)果見表5。由表5可知，在9個食用油樣品中檢出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA和OTB 6種真菌毒素(并不是每個油樣都同時檢出6種真菌毒素)，檢出率達(dá)到32.14%。其檢出樣品中AFB1的檢出率為14.29%，含量為0.601～2.620 μg/kg；AFB2的檢出率為3.57%，含量為0.745 μg/kg；AFG1的檢出率為3.57%，含量為0.751 μg/kg；AFG2的檢出率為10.71%，含量為0.618～0.775 μg/kg；OTA的檢出率為7.14%，含量為3.330～4.387 μg/kg；OTB的檢出率為25.00%，含量為1.519～4.644 μg/kg。

表5 28個食用油樣品中真菌毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA和OTB的含量 μg/kg

3 結(jié) 論

以加標(biāo)回收率為指標(biāo)，優(yōu)化了6種真菌毒素HPLC同步檢測的分析條件，探究了前處理步驟中提取液及比例、萃取劑、提取方式以及流動相梯度洗脫條件、流動相等對真菌毒素HPLC檢測的影響。前處理最優(yōu)條件為：乙腈-水-乙酸(體積比84∶15∶1)作為提取液、超聲作為提取方式以及CHCl3作為DLLME過程的萃取劑。HPLC分析最優(yōu)條件為：流動相A甲醇，流動相B 0.05%甲酸，采用梯度洗脫，流速0.6 mL/min， AFB1、AFB2、AFG1和AFG2激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為460 nm，OTA 和OTB激發(fā)波長為327 nm，發(fā)射波長為460 nm。在最優(yōu)條件下6種真菌毒素線性關(guān)系良好，R2均大于0.999，方法檢出限為0.2～0.5 μg/kg，定量限為 0.6～1.5 μg/kg；樣品的平均加標(biāo)回收率為75.88%～105.25%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～9.5%。該方法可有效同步檢測6種真菌毒素。

采用該方法對市售的28個食用植物油樣品進(jìn)行了檢測，檢出含有AFB1的樣品4個，含有AFB2和AFG1的樣品各1個，含有AFG2的樣品3個，含有OTA和OTB的樣品分別為2個和7個。本方法可有效、準(zhǔn)確地定性定量分析食用植物油中的6種真菌毒素。