朱躍驊，張劍，錢云霞

寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315823

納米材料是指任何一維的幾何尺寸處于納米尺度(1～100 nm)的一種新型材料。其中，納米氧化鋅(ZnO NPs)因其非遷移性、熒光性、壓電性以及可吸收并散射紫外線等特性，使它在制作氣敏傳感器和藥物緩釋劑以及微電子、光催化降解等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿1-3]。同時(shí)，ZnO NPs的廣泛應(yīng)用造成了它在環(huán)境中的濃度快速升高，顯著增加了它與水生生物及人類接觸的風(fēng)險(xiǎn)，這對(duì)生態(tài)環(huán)境，尤其是水環(huán)境[4]造成了極為嚴(yán)重的影響。

魚(yú)類是水環(huán)境中最為常見(jiàn)的脊椎動(dòng)物，同我們?nèi)祟愊⑾⑾嚓P(guān)，為了評(píng)估ZnO NPs對(duì)水環(huán)境中生物的毒性，已有許多學(xué)者通過(guò)斑馬魚(yú)(Barchydanioreriovar)進(jìn)行了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。已有研究報(bào)道，ZnO NPs會(huì)推遲斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育[5]和孵化[6]；Zhao等[7]發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs會(huì)下調(diào)斑馬魚(yú)活性氧相關(guān)基因Bcl2和Nqo1的表達(dá)水平，引起氧化應(yīng)激和DNA損傷；Xiong等[8]發(fā)現(xiàn)，在可見(jiàn)光照射96 h后，ZnO NPs能誘導(dǎo)羥基自由基，從而導(dǎo)致斑馬魚(yú)肝臟發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。ZnO NPs在水體中引起的生物安全問(wèn)題逐漸引起人們的極大關(guān)注[9]，而海洋作為納米顆粒的主要最終歸宿，目前關(guān)于ZnO NPs對(duì)海洋環(huán)境生物影響的研究卻很少。

美國(guó)紅魚(yú)(Sciaenopsocellatus)是一類廣溫、廣鹽性魚(yú)類，具有生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)力強(qiáng)、食性廣泛、產(chǎn)量高和經(jīng)濟(jì)效益顯著等優(yōu)點(diǎn)，是重要的海水養(yǎng)殖品種。肝臟是脊椎動(dòng)物機(jī)體新陳代謝的重要器官，能不斷地調(diào)整其細(xì)胞的生理狀態(tài)以適應(yīng)環(huán)境變化[10]，研究表明，肝細(xì)胞能表達(dá)大部分肝臟功能[11]，而細(xì)胞模型的建立不僅可以減少試驗(yàn)動(dòng)物的使用量，而且具有操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性高和可避免體內(nèi)復(fù)雜因素干擾等優(yōu)點(diǎn)[12]。所以本研究以美國(guó)紅魚(yú)的肝細(xì)胞作為模型來(lái)評(píng)估ZnO NPs的毒性，觀察在不同濃度的ZnO NPs處理后細(xì)胞的活性、吞噬量、氧化應(yīng)激水平以及凋亡情況的改變，探究美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞在ZnO NPs處理后受到的毒性影響，為ZnO NPs對(duì)水生生物的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用美國(guó)紅魚(yú)購(gòu)于浙江省寧波市路林市場(chǎng)，體重(500±75) g，游泳狀況良好，可正常攝食。ZnO NPs購(gòu)于杭州大洋納米新材料有限公司。DEME高糖培養(yǎng)基、青鏈雙抗(penicillin-streptomycin liquid)和胎牛血清(FBS)購(gòu)于Hyclone生物試劑公司。MTT和DCFH-DA干粉購(gòu)于Sigma試劑公司；中性紅和細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于碧云天試劑公司；D-Hanks溶液和紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于北京索萊寶生物公司，丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。流式細(xì)胞儀(Gillios)購(gòu)于美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

ZnO NPs的懸液配制：ZnO NPs溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)，配制成終濃度為500 μg·mL-1的母液，121 ℃高溫高壓滅菌15 min，4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)前超聲30 min，用完全培養(yǎng)基(10%FBS、1%青鏈雙抗和DEME)稀釋[13]至不同濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 紅魚(yú)肝原代細(xì)胞分離

將美國(guó)紅魚(yú)用3-氨基苯甲酸乙酯(10 mg·L-1)麻醉，尾部靜脈抽血后摘取肝臟，在無(wú)血清培養(yǎng)基(0.1%FBS、1%青鏈雙抗和DEME)中仔細(xì)去除血液和結(jié)締組織，剪碎，用PBS洗滌2次，再用2倍體積的胰蛋白酶(0.25%)消化8 min得到細(xì)胞懸液，通過(guò)100 μm篩網(wǎng)過(guò)濾后放入離心管，1 000 r·min-1離心2 min，然后按1∶3的體積比加入D-Hanks和紅細(xì)胞裂解液，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清，加入等體積的D-HANKS溶液，進(jìn)行梯度離心(1 000 r·min-11 min，500 r·min-11 min)，棄上清，加入完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液[14]，用0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)。

用于細(xì)胞毒性測(cè)定的肝細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔100 μL，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，并用無(wú)菌PBS封邊，細(xì)胞濃度為1.5×106cells·mL-1，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用于測(cè)定細(xì)胞對(duì)ZnO NPs的吞噬、胞內(nèi)活性氧(ROS)含量以及細(xì)胞凋亡的肝細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2 mL，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.3 MTT檢測(cè)毒性

將肝細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)后，棄去培養(yǎng)基，分別加入ZnO NPs濃度為12.5、25、37.5和50 μg·mL-1的完全培養(yǎng)基處理6、12和24 h(對(duì)照組不加ZnO NPs)。處理結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，孵育4 h。離心去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)(國(guó)藥分析純)，置搖床上低速振蕩10 min。用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的吸光值OD490 nm，計(jì)算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)組OD值-空白OD值)/(對(duì)照組OD值-空白OD值)×100%。

1.4 中性紅攝取法檢測(cè)毒性

細(xì)胞處理方法同1.3，按中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明檢測(cè)肝細(xì)胞對(duì)中性紅的攝取。

1.5 細(xì)胞吞噬

根據(jù)Suzuki等[15]的方法采用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞對(duì)納米顆粒的吞噬，當(dāng)細(xì)胞攝取非熒光的納米顆粒時(shí)，前向散射(FSC)光線保持恒定的細(xì)胞，其側(cè)向散射(SSC)光的強(qiáng)度會(huì)與納米顆粒的濃度成比例增加。將肝細(xì)胞在含有不同濃度(12.5、25和50 μg·mL-1)的ZnO NPs完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h。處理結(jié)束后，用0.05%胰蛋白酶將細(xì)胞消化，收集至離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液后重懸于0.5 mL的PBS中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)(488 nm激光器)。

1.6 氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

1.6.1 細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝細(xì)胞中的活性氧[16]，肝細(xì)胞處理方法同1.5，6 h后用含有DCFH-DA探針的無(wú)血清培養(yǎng)基孵育20 min，再用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，洗去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA探針，在避光條件下收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng))檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。

1.6.2 MDA含量檢測(cè)

濃度為1×107cells·mL-1的肝細(xì)胞溶液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶過(guò)夜培養(yǎng)后，處理方法同1.5，培養(yǎng)6 h后將細(xì)胞消化，收集至1.5 mL離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，將沉淀破碎，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，用試劑盒進(jìn)行MDA含量的檢測(cè)。

1.7 細(xì)胞凋亡

1.7.1 Hoechst 33342染色

將干凈的蓋玻片在70%乙醇中浸泡后，用無(wú)菌的PBS洗滌3遍，再用完全培養(yǎng)基洗滌一遍。將蓋玻片置于6孔板內(nèi)，加入細(xì)胞懸液(濃度5×106cells·mL-1)。細(xì)胞經(jīng)50 μg·mL-1ZnO NPs處理6 h后，按照Hoechst 33342染色試劑盒的說(shuō)明操作，用熒光顯微鏡觀察肝細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。

1.7.2 Annexin V-FITC/PI染色

肝細(xì)胞處理方法方式同1.5，用細(xì)胞凋亡陽(yáng)性質(zhì)控液處理正常肝細(xì)胞作為空白，F(xiàn)ITC和PI單染。收集處理的肝細(xì)胞用FITC和PI進(jìn)行雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡率的改變。

1.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，以Duncan新復(fù)極差法作多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

美國(guó)紅魚(yú)原代肝細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度的ZnO NPs處理6、12和24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性結(jié)果如圖1(a)所示，細(xì)胞經(jīng)過(guò)ZnO NPs處理6 h后，12.5 μg·mL-1和25 μg·mL-1實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率開(kāi)始減少，但是差異不顯著(P>0.05)，而37.5 μg·mL-1和50 μg·mL-1實(shí)驗(yàn)組降低至對(duì)照組的73%和69%，有顯著差異(P<0.05)；處理12 h后，25、37.5和50 μg·mL-1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，分別為對(duì)照組的71%、52%和40%；處理24 h后，這3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率只有對(duì)照組的58%、34%和17%；而12.5 μg·mL-1實(shí)驗(yàn)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率在各處理時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著變化。

通過(guò)中性紅實(shí)驗(yàn)(NRU)測(cè)定細(xì)胞毒性的結(jié)果如圖1(b)所示。ZnO NPs濃度為12.5 μg·mL-1的實(shí)驗(yàn)組，6 h和12 h組細(xì)胞存活率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P<0.05)，24 h組顯著低于對(duì)照組；25 μg·mL-1ZnO NPs的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞經(jīng)12 h和24 h作用后，細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但12 h與24 h兩組間未有顯著性差異(P>0.05)；ZnO NPs濃度為37.5 μg·mL-1和50 μg·mL-1的實(shí)驗(yàn)組中，6 h組細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，12 h組又顯著低于6 h組(P<0.05)，24 h和12 h無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖1 ZnO NPs對(duì)美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞的毒性作用注：相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；n=3，下同。Fig. 1 Cytotoxic effects of ZnO NPs in hepatocytes of Sciaenops ocellatusNote: The same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05); different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05); the same below.

以上2個(gè)實(shí)驗(yàn)均顯示ZnO NPs產(chǎn)生的細(xì)胞毒性對(duì)濃度和時(shí)間具有依賴性。

2.2 肝細(xì)胞對(duì)ZnO NPs的吞噬

美國(guó)紅魚(yú)的肝細(xì)胞通過(guò)不同濃度的ZnO NPs處理6 h后，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)含物的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。與對(duì)照組相比，ZnO NPs濃度為12.5 μg·mL-1和25 μg·mL-1的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞的SSC-A Mean值有少許上升，但與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，而50 μg·mL-1實(shí)驗(yàn)組較其他3組有顯著性(P<0.05)上升，表明細(xì)胞在50 μg·mL-1ZnO NPs處理6 h后吞噬量顯著(P<0.05)增加。

圖2 美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞對(duì)ZnO NPs的攝取Fig. 2 Cellular uptake of ZnO NPs in hepatocytes of Sciaenops ocellatus

2.3 氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞經(jīng)不同濃度ZnO NPs處理6 h后細(xì)胞內(nèi)的ROS量和脂質(zhì)過(guò)氧化水平如表1所示。結(jié)果表明，12.5 μg·mL-1的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ROS含量與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，而25 μg·mL-1和50 μg·mL-1實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照組的354%和719%，較對(duì)照組有顯著升高(P<0.05)。只有50 μg·mL-1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著高于(P<0.05)對(duì)照組。

表1 ZnO NPs處理6 h后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生量和脂質(zhì)過(guò)氧化水平Table 1 Effect of ZnO NPs treatment for 6 h on intracellular reactive oxygen species (ROS) production and lipid peroxidation

2.4 細(xì)胞凋亡

Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度增高的機(jī)制與凋亡細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變有關(guān)，凋亡細(xì)胞早期細(xì)胞膜的完整性沒(méi)有明顯改變，但細(xì)胞膜的通透性已有增強(qiáng)，因此，進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342比正常細(xì)胞的多，故通過(guò)此方法可定性檢測(cè)ZnO NPs對(duì)美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞的凋亡影響。由圖3可知，對(duì)照組細(xì)胞的肝細(xì)胞多呈細(xì)微的低藍(lán)色，而且密度稀疏，但經(jīng)50 μg·mL-1ZnONPs處理6 h后的細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的改變，Hoechst 33342染料進(jìn)入，細(xì)胞呈現(xiàn)高藍(lán)色，且密度大大增加。

用不同濃度(12.5、25和50 μg·mL-1)ZnO NPs處理美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞6 h后，Annexin V-FITC/PI染色的流式分析結(jié)果如圖4和表2所示。結(jié)果表明，ZnO NPs濃度為12.5 μg·mL-1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率(17.57%)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，25 μg·mL-1和50 μg·mL-1組細(xì)胞凋亡率達(dá)32.8%和60.8%，顯著性高于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

本文探究了ZnO NPs對(duì)美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞的毒性作用，而一些常用的細(xì)胞毒性的測(cè)試系統(tǒng)都已有研究[17-18]，因此，納米材料的細(xì)胞毒性可用2個(gè)或多個(gè)獨(dú)立的測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，以驗(yàn)證研究結(jié)果。筆者采用MTT法和NRU法測(cè)定肝細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同ZnO NPs濃度處理不同時(shí)間后的細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，37.5 μg·mL-1ZnO NPs處理肝細(xì)胞6 h后顯示出明顯的細(xì)胞毒性。細(xì)胞存活率隨著ZnO NPs的濃度增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，即ZnO NPs的毒性存在濃度和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系，這同ZnO NPs處理THP-1巨噬細(xì)胞后的狀況一致[19]，并與ZnO NPs處理鯰魚(yú)(Silurusasotus)原代肝細(xì)胞[20]和虹鱒魚(yú)(Oncorhynchusmykiss)肝瘤細(xì)胞RTH-149[21]的結(jié)果相類似。本研究中，12.5 μg·mL-1ZnO NPs作用24 h后細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯變化，出現(xiàn)急性毒性效應(yīng)的初始濃度為25 μg·mL-1，這與對(duì)鯰魚(yú)和虹鱒魚(yú)的研究結(jié)果一致[20-21]。

圖3 Hoechst 33342染色后細(xì)胞的熒光圖像注：(a)對(duì)照組；(b)ZnO NPs(50 μg·mL-1)處理組。Fig. 3 Fluorescence images of cells stained with Hoechst 33342Note: (a) control; (b) ZnO NPs (50 μg·mL-1) treatment group.

圖4 Annexin V-FITC/PI染色美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析Fig. 4 Flow cytometric analysis of Annexin V-FITC/PI stained hepatocytes of Sciaenops ocellatus

表2 ZnO NPs誘導(dǎo)美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞凋亡Table 2 ZnO NPs induced apoptosis in hepatocytes of Sciaenops ocellatus

ZnO NPs在環(huán)境中不可溶，筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同濃度ZnO NPs作用后，細(xì)胞中的內(nèi)含物顆粒指標(biāo)(SSC)會(huì)出現(xiàn)顯著性(P<0.05)增加，這表明，細(xì)胞會(huì)對(duì)環(huán)境中這種不溶性顆粒進(jìn)行吞噬。進(jìn)一步分析表明，細(xì)胞存活率與SSC值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.721)，說(shuō)明ZnO NPs作為一種外源物，在進(jìn)入生物體內(nèi)后會(huì)被肝細(xì)胞識(shí)別，在產(chǎn)生一些免疫應(yīng)激的同時(shí)也會(huì)被細(xì)胞吞噬，并長(zhǎng)時(shí)間積累在肝臟等器官內(nèi)。在這個(gè)過(guò)程中，免疫系統(tǒng)的過(guò)度應(yīng)激以及納米材料在器官中的積累，都可能會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生較大的毒性。

氧化應(yīng)激指的是機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，活性氧自由基和活性氮自由基等高活性分子大量產(chǎn)生并積累，超過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，即氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡[22]，從而引發(fā)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致機(jī)體組織損傷，如脂質(zhì)過(guò)氧化、酶失活和DNA斷裂等。氧化應(yīng)激通常被認(rèn)為是ZnO NPs引發(fā)生物體細(xì)胞損傷的基本機(jī)制之一[23-24]。ZnO NPs的化學(xué)特征和表面效應(yīng)使其在表面可自發(fā)產(chǎn)生ROS，同時(shí)還可與細(xì)胞組分發(fā)生相互作用，導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生。在本研究中，肝細(xì)胞在含ZnO NPs的培養(yǎng)基中暴露6 h后，25 μg·mL-1和50 μg·mL-1組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量顯著增加(P<0.05)，該結(jié)果與在人淋巴母細(xì)胞(WIL2-NS)[23]和原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞[24]中的研究結(jié)果一致，表明細(xì)胞內(nèi)的ROS含量增加也是ZnO NPs對(duì)魚(yú)類肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性的原因。

MDA是生物膜中多種不飽和脂肪酸在自由基攻擊下形成的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其含量變化可反映出機(jī)體損傷的程度[25]，結(jié)果表明，50 μg·mL-1實(shí)驗(yàn)組紅魚(yú)肝細(xì)胞中的MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，表明細(xì)胞受ZnO NPs的作用后產(chǎn)生過(guò)多的自由基，而這些自由基則攻擊細(xì)胞膜中膜脂的不飽和脂肪酸，從而破壞細(xì)胞膜的完整性，擾亂細(xì)胞功能，進(jìn)而產(chǎn)生過(guò)多的MDA。

筆者通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察到經(jīng)過(guò)ZnO NPs處理后細(xì)胞發(fā)生凋亡，25 μg·mL-1實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，證明了ZnO NPs引起的細(xì)胞死亡模式是細(xì)胞凋亡。之前有研究表明，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞[26]、小鼠表皮正常細(xì)胞[27]和人體肝癌細(xì)胞HepG2[28]進(jìn)行ZnO NPs處理后，誘發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激是造成毒性效應(yīng)的關(guān)鍵，其產(chǎn)生的ROS導(dǎo)致自由基的過(guò)量堆積而線粒體作為細(xì)胞內(nèi)主要的ROS發(fā)生器，通常是高濃度ROS攻擊的目標(biāo)，常常產(chǎn)生有害的結(jié)果，例如線粒體DNA受到氧化損傷[29]從而造成細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量隨ZnO NPs濃度增加而逐漸增加，同時(shí)細(xì)胞凋亡率也隨之升高，與上述文獻(xiàn)的研究結(jié)果類似，由此推斷ZnO NPs引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞死亡的主要方式。

綜上所述，美國(guó)紅魚(yú)肝細(xì)胞經(jīng)ZnO NPs處理后存活率下降，細(xì)胞對(duì)ZnO NPs攝取也隨濃度的升高而升高，同時(shí)伴隨ROS和MDA的含量增加，最后引起細(xì)胞凋亡。

致謝：感謝寧波海洋漁業(yè)研究院申屠紀(jì)康老師為研究提供試驗(yàn)場(chǎng)地。

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