采用科學(xué)方法 準(zhǔn)確檢測(cè)牛的肌肉和肝臟中雙氯芬酸殘留

王方雨 李寧 曹帥 趙雅麗

雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium，CAS 15307- 79-6）作為苯乙酸類衍生物，是非甾體的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，起效較快。在我國(guó)，雙氯芬酸鈉已被批準(zhǔn)用于豬、牛，輔助用于外傷手術(shù)、炎癥等引起的疼痛和發(fā)熱以及奶牛乳房炎的輔助治療等，其在牛的肌肉、肝臟中殘留限量（MRLs）均為5μg/kg，MRLs與歐盟規(guī)定相同。

本文以13C-雙氯芬酸為內(nèi)標(biāo)，以5%氨水乙腈溶液為提取溶劑，以MAX固相萃取柱進(jìn)行凈化，以含有內(nèi)標(biāo)的DCF混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量，參照獸藥殘留檢測(cè)要求，建立了肌肉、肝臟中雙氯芬酸鈉殘留的檢測(cè)方法，可用于牛可食性組織中雙氯芬酸鈉殘留量的測(cè)定。

一、試驗(yàn)材料

1.儀器與設(shè)備。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；BSA224S-CW型分析天平，感量0.0001g，sartorius；BSA423S電子分析天平，感量0.001g，sartorius；Mixer-400型組織勻漿機(jī)，瑞士步琦公司；DK-80型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MX-S渦旋混合器，SCILOGEX，美國(guó)；SORVALL Lynx 4000大容量低溫離心機(jī)，Thermo Scientific，美國(guó)；SPE-24A固相萃取裝置，北京科百特科技有限公司；DC300氮?dú)獯蹈蓛x，杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司。

2.試劑與材料。乙腈、甲醛，質(zhì)譜純；乙腈，分析純；甲酸，分析純；乙酸銨，色譜純；氨水，優(yōu)級(jí)純；Oasis？MAX固相萃取柱，3cc（60mg），美國(guó)Waters公司。

3 .對(duì)照品。雙氯芬酸鈉，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100334-201803，含量按C14H10Cl2NNaO2計(jì)100%。雙氯芬酸-（乙酰苯環(huán)-13C）鈉鹽（同位素標(biāo)記物）， C A S：1 2 6 1 3 9 3-7 3-0，分子式13C6C8H10Cl2NO2Na·4.5H2O，分子量為405.16，Sigma-Aldrich公司，批號(hào)BCBT5244，含量100.0%。

4.試液配制。（1）雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取適量的雙氯芬酸鈉對(duì)照品，以甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；以甲醇稀釋成濃度為10μg/mL的雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液，以及適當(dāng)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。（2）同位素標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取13C-雙氯芬酸對(duì)照品，以甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.2mg/mL的13C-DCF標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；以甲醇稀釋成濃度為10μg/mL的13C-DCF標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液，以及濃度為1μg/mL的13C-DCF標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。（3）定量用系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取一定量的DCF和13C-DCF的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于同一容量瓶中，以甲醇稀釋并定容，配制成13C-DCF濃度為20ng/mL，DCF濃度分別為2ng/mL（LOQ）、10ng/mL（1/2MRL）、20ng/mL（MRL）、40ng/mL（2MRL）的定量用系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

二、試驗(yàn)方法

1.檢測(cè)條件。色譜柱為Agilent Eclipse plus C18，3.0mm×50mm，1.8μm；流動(dòng)相為乙腈-水-甲酸，梯度洗脫；流速0.4mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量為10μL。電噴霧離子源（ESI），正離子模式，毛細(xì)管電壓+4000V，噴霧器壓力35psi，干燥氣溫度350℃，干燥氣流量（氮?dú)猓?0L/min。母離子、子離子、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)需要優(yōu)化。

2.試料制備與保存。取適量新鮮的空白肌肉和肝臟，切割成小塊后均質(zhì)，作為空白試料。取均質(zhì)后的空白組織，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，作為空白添加試料。均在-20℃以下貯存?zhèn)溆谩?/p>

3.樣品前處理。（1）提取。取供試試料（2.0±0.02）g于15mL離心管中，加入10μL濃度為1μg/mL的13C-雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（內(nèi)標(biāo)的添加量與MRL基本一致），渦旋混勻后，加入5%氨水乙腈溶液5mL，渦旋混勻3min，3500g離心10min。移取上清液至另一離心管中。以玻璃棒將沉淀搗碎，加入5%氨水乙腈溶液5mL重復(fù)提取一次，合并提取液，待凈化。（2）凈化。MAX小柱依次以3mL乙腈、3.0mL水活化；將提取液全部過柱，依次用5%氨水乙腈溶液3mL、水3mL淋洗；用2%甲酸乙腈溶液5mL洗脫，收集全部洗脫液，于50℃條件下濃縮至干；加入0.1%的甲酸甲醇溶液0.5mL以完全溶解殘?jiān)?，過0.22μm有機(jī)系微孔濾膜后，濾液供LC-MS/MS檢測(cè)。

4.測(cè)定。（1）定性測(cè)定。在儀器最佳工作條件下，被測(cè)組分選擇1個(gè)母離子和2個(gè)特征子離子，在相同試驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)，將樣品譜圖中各組分定性離子的相對(duì)離子豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)離子豐度進(jìn)行比較，若偏差不超過表1規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。

（2）定量測(cè)定。在儀器最佳工作條件下，取試樣溶液和相應(yīng)濃度的含有內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計(jì)算。

5.檢測(cè)限（LOD）與定量限（LOQ）測(cè)定。取系列濃度的DCF標(biāo)準(zhǔn)工作液，及13C-DCF標(biāo)準(zhǔn)工作液添加于空白試料中，制得不同濃度的空白添加試料，每個(gè)濃度制備6個(gè)平行樣，按上述的樣品前處理方法處理樣品，做LC-MS/MS測(cè)定，共重復(fù)3次。采用峰高對(duì)峰高的方法，計(jì)算信噪比（SNR），取SNR≥3時(shí)的濃度為檢測(cè)限。結(jié)合準(zhǔn)確性和精密度試驗(yàn)，取信噪比SNR≥5時(shí)的濃度為定量限。

6.回收率與精密度測(cè)定。準(zhǔn)確稱取空白試料各2.0g，分別添加濃度為0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和2.0μg/mL的DCF系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各10μL，以及濃度為1μg/mL的13C-DCF標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10μL，混勻，制得13C-DCF添加濃度均為5 ng/g，DCF添加濃度分別為0.5ng/g（LOQ）、2.5ng/g（1/2MRL）、5.0ng/g（MRL）和10.0ng/g（2MRL）的空白添加試料，每個(gè)濃度制備6個(gè)平行樣，共重復(fù)3次。將制得的樣品按照上述前處理方法處理后，作HPLC-MS/MS測(cè)定；同時(shí)配制定量用系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與待測(cè)樣品同時(shí)檢測(cè)，采用單點(diǎn)校正進(jìn)行定量計(jì)算，評(píng)估方法的回收率，以及日內(nèi)和日間精密度。

三、結(jié)果

1.質(zhì)譜和色譜條件優(yōu)化。參照楊亞軍等的方法，在ESI+模式下確定DCF及內(nèi)標(biāo)的母離子、子離子等，優(yōu)化后的MRM參數(shù)見表2，優(yōu)化后的梯度洗脫程序見表3。

2.色譜行為。肌肉、肝臟組織的色譜圖分別見圖1和圖2。結(jié)果顯示，空白基質(zhì)在相應(yīng)位置處沒有干擾。

4.回收率及精密度。不同空白組織及牛奶中，DCF的加樣回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果見表6、表7。不同組織中DCF的平均加樣回收率均在70%-120%之間，日內(nèi)和日間精密度均在15%以內(nèi)，符合獸藥殘留的檢測(cè)要求。

四、討論

我國(guó)在對(duì)動(dòng)物源性食品中獸藥殘留進(jìn)行分析時(shí)，規(guī)定了方法的檢測(cè)限與最高殘留限量（MRL）相應(yīng)值的數(shù)值關(guān)系，最高殘留限量≤50μg/kg時(shí)，定量限可低于或等于最高殘留限量。本研究建立的雙氯芬酸鈉殘留量的HPLC-ESI+-MS/MS檢測(cè)方法，在肌肉、肝臟中LOD為0.3μg/kg，LOQ為0.5μg/kg。LOQ能達(dá)到歐盟所規(guī)定的殘留限量要求，回收率、變異系數(shù)等指標(biāo)也符合動(dòng)物源性食品中獸藥殘留檢測(cè)的方法學(xué)要求。本方法穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)便易行，可用于?？墒承越M織中雙氯芬酸鈉殘留量的測(cè)定，以及雙氯芬酸鈉注射液給藥后?？墒承越M織中雙氯芬酸鈉的殘留消除研究。

感謝國(guó)家重點(diǎn)研究計(jì)劃：養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量安全保障技術(shù)應(yīng)用示范（2019YFC1605700）的大力支持。

通訊作者：王方雨（1978.11-），男，副研究員，河南南陽，主要研究方向：生物技術(shù)。