王韋華，王錄軍，魏 恒，吳奇強，白 鴿，郭抗抗

(1.渭南職業(yè)技術學院, 陜西 渭南 714026；2.渭南市動物疫病預防控制中心,陜西 渭南 714000; 3.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院, 陜西 楊凌 712100)

牛乳是人類重要的營養(yǎng)食品，生鮮乳的衛(wèi)生質量關乎人類食用安全。細菌污染是影響生鮮乳衛(wèi)生質量的主要問題，特別是食源性致病菌，如金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的危害尤為嚴重，在我國被列為生鮮乳及其制品中微生物檢測的主要對象[1]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)是一種人獸共患病原菌，在一定條件下引起人和動物發(fā)病，由于其在生長繁殖過程中可產(chǎn)生腸毒素，也是引起人食物中毒的主要微生物之一[2]。生鮮乳具有豐富的營養(yǎng)成分也是細菌良好的培養(yǎng)基，如果受到細菌污染后會迅速發(fā)生變質或細菌在繁殖過程中產(chǎn)生有害物質，對消費者健康造成直接的危害[3]。對國內(nèi)外生鮮乳中金黃色葡萄球菌的污染調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其污染狀況存在較大差異，王文博等(2016)對山東省2個地市采集的生鮮牛乳進行檢測發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌的陽性率達到55.26%[4]；何源等2012年對重慶市生鮮牛乳的檢測發(fā)現(xiàn)SA的陽性率為21.67%[5]；李希強等(2017)對來自內(nèi)蒙古的生鮮牛乳檢測發(fā)現(xiàn)SA陽性率為14.7%[6]。這些研究表明，生鮮牛乳中SA的污染在不同地區(qū)存在差異，主要和奶牛場的生物安全措施、衛(wèi)生措施、擠乳方式和儲存運輸?shù)冗^程密切相關。金黃色葡萄球菌污染生鮮牛乳一般有兩條途徑:一是奶牛感染金黃色葡萄球菌，乳中將會存在細菌，即內(nèi)源性污染(一次污染)；二是在擠乳、保存、運輸?shù)冗^程中衛(wèi)生狀況不良，受到細菌污染(二次污染)。

我國奶牛養(yǎng)殖模式主要有規(guī)?；B(yǎng)殖場、奶牛養(yǎng)殖小區(qū)和散養(yǎng)戶等，受經(jīng)濟發(fā)展水平的影響，不同地區(qū)奶牛養(yǎng)殖規(guī)模和生鮮乳的銷售方式也存在較大差別。一些養(yǎng)殖小區(qū)和散養(yǎng)戶對生鮮乳進行直接面向消費者銷售，也對食用安全帶來隱患。

渭南市是陜西省奶牛養(yǎng)殖比較集中的地區(qū)，截止2019年底，全市奶牛養(yǎng)殖規(guī)模69 900頭。養(yǎng)殖模式有規(guī)?；?、養(yǎng)殖小區(qū)和農(nóng)戶散養(yǎng)，對生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的污染狀況調(diào)查較少。筆者研究對渭南地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的污染狀況進行調(diào)查，在奶牛養(yǎng)殖場分別調(diào)查牛場性質、環(huán)境衛(wèi)生、擠奶前的準備工作、擠奶方式與生鮮奶盛裝運輸?shù)裙ぷ?，結合乳樣中金黃色葡萄球菌的檢出情況，分析以上因素對乳中金黃色葡萄球菌污染的影響，為保障生鮮牛乳衛(wèi)生和食用安全提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 細菌和試劑

金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC 29213)，由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)公共衛(wèi)生與食品安全實驗室保存；牛源大腸埃希菌、沙門氏菌、無乳鏈球菌、銅綠假單胞菌，均由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)公共衛(wèi)生與食品安全實驗室分離鑒定并保存。細菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN BIOTECH(北京)公司；7.5%NaCl肉湯、Baird-Parker瓊脂、MH肉湯、生化反應管；2×Taq MasterMix購自康為世紀生物科技有限公司；DNA Marker DL2000，購自北京全式金生物技術有限公司；EB、溶菌酶、RNase A，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 乳樣采集與處理

2019年3-4月份，選擇渭南市臨渭區(qū)、高新區(qū)、經(jīng)開區(qū)的14個奶牛養(yǎng)殖場(1個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場、2個養(yǎng)殖小區(qū)、11個奶牛養(yǎng)殖戶)作為調(diào)查對象。從3月12日至4月24日，分7次從以上牛場采集乳樣，每次從奶桶中采集混合乳樣1份，共得到98份乳樣。對樣品進行標記后低溫保存帶回實驗室進行檢測。

1.3 奶牛養(yǎng)殖場生鮮乳生產(chǎn)影響因素的確定

生鮮乳的細菌污染與養(yǎng)殖場環(huán)境、養(yǎng)殖方式、擠奶前的衛(wèi)生處理、擠奶方式及鮮乳盛裝運輸?shù)拳h(huán)節(jié)密切相關。在對14個養(yǎng)殖場基本情況調(diào)查的基礎上，將牛場規(guī)模(A)、飼養(yǎng)和環(huán)境消毒(B)、擠乳前處理(C)、擠乳方式(D)、生鮮乳儲運和銷售(E)等作為分析細菌污染生鮮乳的關鍵考察點。具體考察內(nèi)容見表1。

表1 生鮮乳衛(wèi)生狀狀況影響因素考察表

1.4 乳樣中金黃色葡萄球菌的PCR檢測

1.4.1 金黃色葡萄球菌三重PCR檢測方法的驗證 取金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、大腸埃希菌、沙門氏菌、無乳鏈球菌、銅綠假單胞菌的菌懸液各1 mL，按照TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒說明書程序提取DNA。以本項目組建立的金黃色葡萄球菌三重PCR方法[7]，對以上細菌DNA進行檢測，驗證方法的特異性。

反應體系(20 μL)：包括ddH2O 5.0 μL，2×Taq MasterMix 10.0 μL，Primer F-SEA及Primer R- SEA各0.4 μL，Primer F-NUC及Primer R- NUC各0.7 μL，Primer F-BLAZ及Primer R-BLAZ各0.9 μL，DNA模板1.0 μL。PCR反應條件為：94℃ 2 min，94℃ 30 s，61℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。

1.4.2 乳樣中細菌DNA的提取和檢測 取50 mL離心管，加入5 mL乳樣，再加入無水乙醇1 mL、氨水1 mL和石油醚1 mL，混合均勻?；旌衔镌?℃下，12 000 r·min-1離心l0 min，棄去上清液，然后向沉淀中加入1 mL 70%乙醇，混勻，按TIANamp細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA的提取，置-20℃條件保存。

用建立的PCR方法，對從渭南地區(qū)采集的98份生鮮牛乳樣品中金黃色葡萄球菌進行檢測，以金黃色葡萄球菌懸液原液DNA作陽性對照，ddH2O作陰性對照。

1.4.3 金黃色葡萄球菌的分離鑒定 將經(jīng)PCR檢測為金黃色葡萄球菌陽性的乳樣，按照GB 4789.10-2016中規(guī)定的金黃色葡萄球菌檢測方法，先在7.5%NaCl肉湯中增菌培養(yǎng)后，將增菌后的培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和高鹽甘露醇培養(yǎng)基瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)24～48 h。觀察菌落形態(tài)和染色鏡檢，對可疑菌落做金黃色葡萄球菌PCR檢測。

1.5 奶牛養(yǎng)殖場生鮮乳生產(chǎn)影響因素與金黃色葡萄球菌污染的相關性分析

對14個養(yǎng)殖場的規(guī)模(A)、飼養(yǎng)和環(huán)境消毒(B)、擠乳前處理(C)、擠乳方式(D)、生鮮乳儲運和銷售(E)等進行統(tǒng)計分析，明確以上因素對生鮮乳金黃色葡萄球菌污染的相關性。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌PCR檢測方法的驗證

分別以金黃色葡萄球菌標準菌株、大腸埃希菌、沙門氏菌、無乳鏈球菌、銅綠假單胞菌的DNA為模板，用建立的以SEA、BLAZ和NUC基因為檢測對象的三重PCR進行擴增。凝膠電泳結果顯示，在金黃色葡萄球菌標準株DNA中出現(xiàn)3條帶，分別為NUC基因(124 bp)、SEA基因(248 bp)、BLAZ基因(308 bp)；在其他細菌DNA中未有擴增產(chǎn)物，說明建立的方法特異性良好，可用于金黃色葡萄球菌的檢測(圖1)。

2.2 乳樣中金黃色葡萄球菌的檢測

2.2.1 乳樣中金黃色葡萄球菌的PCR檢測 用檢測金黃色葡萄球菌三重PCR方法對提取的乳樣中DNA進行檢測，對PCR產(chǎn)物凝膠電泳觀察發(fā)現(xiàn)在10份乳樣中出現(xiàn)金黃色葡萄球菌特異性條帶，判定為金黃色葡萄球菌陽性(陽性率10.2%)。部分樣品的檢測電泳圖見圖2A和2B。

2.2.2 PCR陽性乳樣中金黃色葡萄球菌的分離鑒定 按照國標方法對經(jīng)PCR檢測為金黃色葡萄球菌為陽性的乳樣進行細菌的分離，在高鹽甘露醇培養(yǎng)基瓊脂平板上可見到圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色的菌落(圖3A)，在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤、灰黑色至黑色，有光澤的菌落(圖3B)。對疑似金黃色葡萄球菌進行革蘭氏染色、鏡檢，可見到分離菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5～1 μm(圖3C)。對分離的疑似金黃色葡萄球菌進行PCR檢測，結果表明可擴增得到特異性的條帶(圖3D)，說明分離菌為金黃色葡萄球菌。從PCR陽性的10份乳樣中分離到金黃色葡萄球菌。

2.3 采樣奶牛場與鮮乳生產(chǎn)相關影響因素調(diào)查結果

對14個養(yǎng)殖場的規(guī)模(A)、飼養(yǎng)和環(huán)境消毒(B)、擠乳前處理(C)、擠乳方式(D)、生鮮乳儲運和銷售(E)等進行統(tǒng)計分析。結果表明：①養(yǎng)殖場的規(guī)模(A)：2個采樣點為養(yǎng)殖小區(qū)(A1)，1個采樣點為規(guī)?；B(yǎng)殖(A2)，其余11個牛場均屬于農(nóng)戶小規(guī)模散養(yǎng)(A3)，養(yǎng)殖規(guī)模6～11頭。②飼養(yǎng)和環(huán)境消毒(B)：所有奶牛場及牛舍均堅持定期消毒(B1)；多數(shù)工作人員、用具及飼養(yǎng)過程中隨時消毒(B2)；除采樣點之外，奶牛單獨飼養(yǎng)，未與其他動物混養(yǎng)(B3)；所有采樣點在鮮乳盛裝、貯藏與運輸過程中都進行消毒(B4)。③擠乳前處理(C)：多數(shù)養(yǎng)殖場擠奶前工作人員會穿戴工作服(C1)、洗凈雙手(C2)；對牛乳房會進行清洗和消毒(C3)；只有養(yǎng)殖小區(qū)和規(guī)?；B(yǎng)殖場擠奶前對乳房進行藥浴(C4)。④擠乳方式(D)：大多數(shù)散養(yǎng)場擠乳前沒有廢棄頭3把奶；除采樣點采用人工擠奶(D2)之外，其余采樣點均采用擠奶器擠奶(D1)。⑤生鮮乳儲運和銷售(E)：均為多個奶牛的混合奶樣(E2)；養(yǎng)殖小區(qū)和規(guī)?；B(yǎng)殖場以集中銷售為主(E4)，散養(yǎng)戶均為零散銷售(E3)。統(tǒng)計結果見表2。

表2 采樣奶牛場與鮮乳生產(chǎn)相關影響因素調(diào)查結果

2.4 不同養(yǎng)殖場金黃色葡萄球菌的檢測結果

本次調(diào)查主要針對不同奶牛養(yǎng)殖場生鮮乳受金黃色葡萄球菌污染的調(diào)查，每次采樣均為奶牛場乳樣混合樣品，每個場每次采樣1份，共采樣7次(約每周采樣一次)。檢測結果發(fā)現(xiàn)，在4個養(yǎng)殖場的乳樣中檢測到金黃色葡萄球菌，7次采樣樣品中，金黃色葡萄球菌檢測1次陽性的有1個場，2次陽性的2個場，5次陽性的1個場。具體為采樣點乳品中檢出率較高，達到71.43%(5/7)，采樣點⑤和的檢出率為28.57 %(2/7)，采樣點⑥的檢出率為14.29 %(1/7)，統(tǒng)計結果見表3。

表3 各奶牛場乳樣中金黃色葡萄球菌的檢測結果

對采樣時間和金黃色葡萄球菌污染相關性分析顯示，金黃色葡萄球菌對生鮮乳的污染與采樣時間無相關性。對檢出金黃色葡萄球菌的4個養(yǎng)殖場基本情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，均為家庭小規(guī)模養(yǎng)殖(奶牛頭數(shù)6～9頭)，擠乳后對鮮乳混合后進行零售；5次檢測為陽性的牛場存在奶牛與其他動物混養(yǎng)、手工擠奶、擠乳前未對雙手和牛乳房進行充分清洗和消毒。說明養(yǎng)殖環(huán)境和擠乳衛(wèi)生狀況對生鮮乳的衛(wèi)生質量有顯著影響。

3 討論

金黃色葡萄球菌是常見的革蘭氏陽性食源性細菌，主要致病因子為分泌的外毒素，如腸毒素、溶血毒素和殺白細胞素等，是引起人食物中毒的常見病原，同時也能感染人和動物而引起感染和發(fā)病。奶牛乳房炎是嚴重影響奶牛健康和乳品衛(wèi)生質量的問題，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，多項研究表明金黃色葡萄球菌在奶牛乳房炎發(fā)生中具有重要作用。除了奶牛感染而使乳中攜帶金黃色葡萄球菌外，在生鮮乳生產(chǎn)過程中衛(wèi)生狀況不良也造成污染的主要來源。Sukanya T等(2020)對日本北海道奶牛原料乳中分離的金黃色葡萄球菌的流行情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在北海道的3個奶牛場采集436份無乳房炎特征的乳樣，其中135份檢出金黃色葡萄球菌，陽性率為30.96%[8]。范亞楠等(2015)對安徽蕪湖地區(qū)的185份生鮮牛乳通過PCR方法檢出金黃色葡萄球菌49株，陽性率26.5%[9]。張玲等(2019)對浙江杭州市某奶牛場99份生鮮乳中分離到5株金黃色葡萄球菌(5.1%)[10]。韓淑芳等(2016)從山西某奶牛場隨機采集25份奶樣，進行細菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、H2O2酶試驗鑒定，分離出18株金黃色葡萄球菌，呈現(xiàn)較高的金黃色葡萄球菌污染[11]。從國內(nèi)外的研究結果可以看出，不同地區(qū)、奶牛場生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的陽性率存在較大差異[12～16]。

我們對陜西省渭南市14個生鮮牛乳采樣點的調(diào)查及檢測結果分析，在4個養(yǎng)殖場的乳樣中檢測到金黃色葡萄球菌，7次采樣樣品中，金黃色葡萄球菌檢測1次陽性的有1個場，2次陽性的2個場，5次陽性的1個場。對采樣時間和金黃色葡萄球菌污染相關性分析顯示，金黃色葡萄球菌對生鮮乳的污染與采樣時間無相關性。對檢出金黃色葡萄球菌的4個養(yǎng)殖場基本情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，均為家庭小規(guī)模養(yǎng)殖(奶牛頭數(shù)6～9頭)，擠乳后對鮮乳混合后進行零售；5次檢測為陽性的牛場存在奶牛與其他動物混養(yǎng)、手工擠奶、擠乳前未對雙手和牛乳房進行充分清洗和消毒。深入調(diào)查，我們也發(fā)現(xiàn)小規(guī)模式散養(yǎng)場不能定期對動物及飼養(yǎng)環(huán)境進行消毒，難以發(fā)現(xiàn)一些隱性疾病或者不合格奶樣，特別是乳房炎，可能是造成牛乳污染的一個重要原因。有的奶牛場在擠乳前沒有對乳房進行擦洗、消毒和藥浴，也沒有廢棄頭3把奶。個別養(yǎng)殖場擠乳時幾乎都不藥浴，會造成細菌的繁殖和相互感染。另外，用擠奶機擠奶時很難發(fā)現(xiàn)不正常奶樣，造成混合乳樣的污染等。說明養(yǎng)殖環(huán)境和擠乳衛(wèi)生狀況對生鮮乳的衛(wèi)生質量有顯著影響。

筆者研究表明渭南地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場生鮮牛乳的金黃色葡萄球菌污染率較低，造成金黃色葡萄球菌污染與奶牛養(yǎng)殖環(huán)境、擠乳前的消毒工作、擠乳方式密切相關，良好的養(yǎng)殖環(huán)境和擠乳方式將大大降低金黃色葡萄球菌對乳的污染。