曹知勇 張青槐 龐宇舟

廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心/廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種類(lèi)風(fēng)濕因子侵犯滑膜、關(guān)節(jié)的慢性免疫性疾病，最明顯的病理反應(yīng)是對(duì)機(jī)體關(guān)節(jié)和骨質(zhì)的破壞。同時(shí)，它也能引起全身性的并發(fā)癥，如肺炎、泌尿系感染、口腔潰瘍等。然而由于對(duì)于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病機(jī)病因認(rèn)識(shí)并不徹底，導(dǎo)致類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，差異性較大。目前行之有效的治療RA的藥物分為4大類(lèi):NSAIDs、DMARDs、糖皮質(zhì)激素及植物藥制劑[1]，可是都易形成耐藥性。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程常常伴隨著血細(xì)胞的變化，尤其以血小板的活化最為相關(guān)。血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)和血小板活化因子(PAF)作為血小板活化后的產(chǎn)物，是RA過(guò)程中血小板活化的標(biāo)準(zhǔn)性指標(biāo)[2]。青風(fēng)藤是防己科植物青藤(Sinomeniumacuturn)及毛青藤(Sinameniumacutum)的干燥藤莖，是壯藥龍鉆通痹方的主要組成藥物，能通“龍路”“火路”，臨床上多用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，且療效顯著。青藤堿是壯藥青風(fēng)藤的主要化合物，具有抗炎、抑制移植物排斥、抗腫瘤以及抑制免疫等藥理作用[3]。但對(duì)RA患者的血小板的影響機(jī)制還不明確。本實(shí)驗(yàn)就此現(xiàn)狀，望探究出青藤堿在治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的過(guò)程中對(duì)血小板因子PDGF、PAF表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康(SD)大鼠40只，8～10周齡，雄性，體質(zhì)量(180±20)g(湖南斯萊克景達(dá),SCXK(湘)2016-002)，適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 材料 青風(fēng)藤干燥藤莖(購(gòu)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)韋松基鑒定為防己科植物青藤藤莖(Sinomeniumacuturn)；天然牛Ⅱ型膠原蛋白、完全弗氏佐劑、P-選擇素檢測(cè)試劑盒、PECAM-1檢測(cè)測(cè)試盒購(gòu)自與南寧市鵬碧實(shí)驗(yàn)室器材經(jīng)營(yíng)部。

2 方法

2.1 分組與造模 將40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組8只以及造模組32只，將溶于醋酸的牛Ⅱ型膠原蛋白先于4 ℃低溫保存過(guò)夜，第2 d與完全弗氏佐劑以等體積乳化，乳化成功后，對(duì)模型組大鼠背部及尾部多點(diǎn)行皮下注射，誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型；空白對(duì)照組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液[4]。

2.2 造模評(píng)分 按照關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠進(jìn)行評(píng)分，首次注射后每3 d稱(chēng)重1次，每周固定兩名實(shí)驗(yàn)員記錄關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分。

2.3 給藥 造模后第21 d進(jìn)行關(guān)節(jié)評(píng)分，評(píng)分>4分即認(rèn)定為造模成功。成模大鼠隨機(jī)分為模型組(n=8)和青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組、青藤堿高劑量組。分組后開(kāi)始給藥：青藤堿組灌胃給予青藤堿的混懸液，低劑量組給藥青藤堿5 mg/kg/d；中劑量組給與10 mg/kg/d；高劑量組給藥20 mg/kg/d。模型組與對(duì)照組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液；灌胃劑量按照10 mL/kg/d，每天1次，持續(xù)28 d。

2.4 實(shí)驗(yàn)取材 造模成功后，行第一次眼眶取血，離心保存血清。第二輪取血于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后；此次取血先禁食一夜，次日于大鼠眼眶取血。ELISA法測(cè)定血清中PDGF、PAF水平，操作方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠足關(guān)節(jié)指數(shù)的變化 造模后，大鼠多關(guān)節(jié)腫脹明顯，并伴有明顯紅腫；給藥后，大鼠關(guān)節(jié)明顯好轉(zhuǎn)。給藥第7、14、21 d時(shí)，壯藥青藤堿高劑量組足關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分明顯低于模型組(P<0.05)，第28 d顯著低于模型組(P<0.01)；給藥第7、14、21、28 d，壯藥青藤堿中劑量組關(guān)節(jié)指數(shù)明顯下降，關(guān)節(jié)腫脹改善情況優(yōu)于模型組(P<0.05)；給藥第14、21、28 d，壯藥青藤堿低劑量組關(guān)節(jié)指數(shù)下降，關(guān)節(jié)腫脹改善情況優(yōu)于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)的變化情況

3.2 各組大鼠血清PDGF、PAF的表達(dá)情況 給藥后，壯藥青藤堿高劑量組和空白組大鼠血清PDGF、PAF的表達(dá)顯著下降，且低于模型組(P<0.01)；壯藥青藤堿中、低劑量組大鼠血清PDGF、PAF的表達(dá)明顯下降，且低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 壯藥青風(fēng)藤總生物堿對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠PDGF、PAF表達(dá)的影響

4 討論

RA在我國(guó)的發(fā)病率僅約為0.35%，但由于我國(guó)人口基數(shù)大，患病總?cè)藬?shù)超500萬(wàn)，嚴(yán)重影響人民身心健康，甚至在某些地區(qū)，患者中存在很高的抑郁率，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān)。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和多種炎癥因子相關(guān)，如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、IL-4[5]、IL-6、IL-17[6]、IL-10、IL-1[7]、IL-1β[8]等。董文哲等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血細(xì)胞血小板的計(jì)數(shù)變化和RA的關(guān)系尤為密切，血小板的激活和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)；而血小板的激活必然會(huì)分泌PDGF和PAF，導(dǎo)致PDGF和PAF在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)中呈現(xiàn)高表達(dá)[10]。

壯醫(yī)認(rèn)為，RA屬于壯醫(yī)“發(fā)旺”(壯名：Fungcaep)范疇。該病的主要發(fā)病機(jī)理為風(fēng)、寒、濕、熱等毒邪乘虛侵入人體，阻滯“龍路” “火路”，使氣血運(yùn)行不暢，痹阻于筋骨肌肉、關(guān)節(jié)所致；治療當(dāng)祛風(fēng)除濕，行氣消腫止痛。壯藥龍鉆通痹方是壯醫(yī)治療活動(dòng)期RA的經(jīng)驗(yàn)方，該方遵循壯醫(yī)主幫配伍的組方原則。由飛龍掌血、大鉆、八角楓、兩面針、青風(fēng)藤、九龍?zhí)俚冉M成，能疏通“龍路”“火路”之瘀滯，直接祛邪外出，恢復(fù)天、人、地三氣的同步運(yùn)行，從而達(dá)到治療目的。

青藤堿是壯藥青風(fēng)藤治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要有效的化學(xué)成分，現(xiàn)代臨床及實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青藤堿治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床效果顯著，對(duì)類(lèi)風(fēng)濕發(fā)病過(guò)程中的各種炎性因子都有一定的影響。如能降低細(xì)胞因子IL-1、IL-6[14]、IL-1、IL-17[15]、TNF-α等的表達(dá)；還能上調(diào)IL-4[16]的表達(dá)，從而減輕類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜增生和骨破壞。但是對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中血小板的影響情況卻研究不多。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青藤堿對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的血小板因子PDGF和PAF有抑制作用，并能有效緩解大鼠關(guān)節(jié)腫脹，達(dá)到治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效果。但在藥物濃度上有一定的要求。