徐長卿丹皮酚對骨癌痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的研究

赫錦錦,方 東

(1. 河南大學第一附屬醫(yī)院藥學部，河南 開封 475000；2. 河南大學藥學院藥理學教研室，河南 開封 475004)

原發(fā)性骨腫瘤或其他部位腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、肺癌)的骨轉移都會導致骨癌痛的發(fā)生，嚴重影響病人的生活質量[1]。臨床上用于骨癌痛的藥物主要是阿片類藥物，然而這類藥物具有耐受性和成癮性，因此臨床上亟需開發(fā)鎮(zhèn)痛效果好、成癮性低的鎮(zhèn)痛藥物[2-3]。

蘿藦科植物徐長卿的干燥根、根莖及帶根全草可用于風濕痹痛、腰痛、跌打損傷痛等痛證的治療，療效明顯[4-5]。大量研究表明，徐長卿最主要的藥理成分是丹皮酚[6-7]，然而，徐長卿丹皮酚(Paeonol of Cynanchum paniculatumhas, Paeonol)是否具有抗骨癌痛的作用還不清楚，因而本研究采用乳腺癌誘發(fā)的骨癌痛大鼠模型評價徐長卿丹皮酚抗骨癌痛的作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑徐長卿丹皮酚(貨號：H111081)購于阿拉丁公司(上海，中國)，兔源TRPV1多克隆抗體(貨號：ab6166)，小鼠源transferrin receptor單克隆抗體(貨號：ab1086)購于英國Abcam公司，小鼠源β-actin單克隆抗體(貨號：TA-09)購于中杉金橋(北京，中國)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(貨號：sc-2054)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(貨號：sc-2973)購于Santa Cruz公司(MN, USA)。

1.2 實驗動物健康雌性Sprague-Dawley大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。大鼠初始體質量為(160～180) g，分籠飼養(yǎng)于SPF級動物房中，動物房室溫控制在(23±2) ℃，相對濕度控制在70%±10%，大鼠自由飲水和飲食。

1.3 骨癌痛大鼠模型的建立將復蘇后的大鼠乳腺癌MRMT-1細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，當細胞處于對數(shù)生長期時進行傳代培養(yǎng)，收集傳代2次后的細胞用于骨癌痛模型的建立。用PBS緩沖液將收集的MRMT-1細胞稀釋成1×1010個·L-1的細胞懸液，用微量進樣器將4 μL上述細胞懸液(4×104個)接種于大鼠左后肢脛骨骨髓腔內(nèi)，建立骨癌痛大鼠模型，對照組大鼠給予等量的PBS溶液。

1.4 機械痛閾值的測定按照Chaplan等[8]報道的“up and down”方法，測定大鼠左后肢的機械痛閾(paw withdrawal threshold，PWT)。首先將大鼠放置在用于測定機械痛的有機玻璃籠中，并保持室內(nèi)安靜以防大鼠出現(xiàn)躁動。當大鼠安靜后，用一系列標準化的von Frey hair刺激大鼠左后肢足墊中部，每次刺激持續(xù)時間約5 s，觀察大鼠是否出現(xiàn)縮足反應，不同刺激之間相隔5 min以上，以消除上一次刺激對大鼠的影響，根據(jù)“up and down”方法計算50%縮足閾值。

1.5 熱輻射痛閾值的測定將大鼠置于有機玻璃套筒(18 cm × 6 cm × 6 cm) 內(nèi)，使其適應30 min，待大鼠安靜后開始測試。將熱輻射光源對準大鼠左側足墊正下方，開啟光源并計時，出現(xiàn)抬足現(xiàn)象為陽性反應，大鼠出現(xiàn)陽性反應后立即關閉熱輻射光源，記錄該次大鼠的抬足潛伏期(paw withdraw latency，PWL)。為了保證測試結果的準確性，每只大鼠左后肢至少重復測量3次，每次測試間隔5 min以上，最后取3次PWL的平均值記為大鼠的熱輻射痛閾。

1.6 大鼠DRG中蛋白的提取及Western blot實驗總蛋白的提?。捍笫髷囝^處死后，迅速取出左側L4，L5的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)置于1.5 mL EP管中，加入100 μL RIPA裂解液，以25%的強度超聲破碎DRG至無組織塊出現(xiàn)，將其放置在冰上繼續(xù)裂解30 min，然后12 000 r·min-1離心10 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量，取40 μg總蛋白進行Western blot 實驗。

膜蛋白的提?。喝〈笫驦4，L5 DRG置于玻璃研磨器中，加入800 μL膜成分提取液(0.3 mol·L-1Sucrose，10 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1PMSF，1 mmol·L-1DTT，10 mg·L-1Leupeptin)，按照Black等[9]的方法進行超高速離心得到膜成分，之后用含有1% Triton X-100的RIPA裂解液冰上裂解1 h，12 000 r·min-1離心10 min后取上清，定量，取20 μg膜蛋白進行Western blot 實驗。

Western blot實驗：每組樣品取等量的蛋白在10%的SDS-PAGE分離膠中以120 V的電壓進行電泳分離2 h。電泳結束后，再通過200 mA的電流轉膜2 h，將蛋白轉移到PVDF膜上。然后取出PVDF膜置于5%脫脂奶中室溫封閉1 h。封閉之后，使用5%脫脂奶分別稀釋TRPV1抗體(1：1 000)、β-actin抗體(1 ∶2 000)、transferrin抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育上述抗體過夜。一抗孵育完成后，再在室溫下用相應的二抗孵育1 h，采用ECL試劑盒顯色，用Quantity One軟件分析條帶光密度值。

1.7 電生理記錄大鼠DRG神經(jīng)元的興奮性和TRPV1電流大鼠DRG神經(jīng)元的急性分離：斷頭處死大鼠，快速取出左側L4和L5 的DRG，置于預冷的DMEM培養(yǎng)基中，快速洗滌2次，加入1.5 mL膠原酶，37 ℃消化45 min；然后棄去膠原酶，用DMEM洗滌2次，加入1.5 mL胰酶，繼續(xù)消化10 min。當胰酶消化結束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，然后加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，用拋光后的巴斯德管吹打DRG，使神經(jīng)元分散至培養(yǎng)基中。最后將分散后的神經(jīng)元接種在24孔培養(yǎng)板中(24孔板中提前放置有多聚賴氨酸包被過的蓋玻片)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后進行電生理實驗。

全細胞膜片鉗記錄：選取直徑小于25 μm的DRG神經(jīng)元，在電流鉗模式下，將神經(jīng)元鉗制于0 pA，記錄各組神經(jīng)元的靜息膜電位(resting membrane potential，RMP)，此后采用階梯式給予一系列去極化電流，每次躍遷5 pA，持續(xù)100 ms，直至誘發(fā)出第一個動作電位，即為動作電位的去極化電流閾值(current threshold，CT)，并同時記錄動作電位爆發(fā)的閾值(threshold of action potential，TP)。然后給予恒定去極化電流(300 pA, 500 ms)刺激DRG神經(jīng)元，記錄相同刺激下每個神經(jīng)元爆發(fā)動作電位的個數(shù)。最后在電壓鉗模式下，將神經(jīng)元的電壓鉗制在-70 mV，執(zhí)行TRPV1受體激動劑辣椒素(Capsaicin，CAP)灌流給藥步驟(細胞外液2 s，激動劑3 s，細胞外液20 s)，記錄TRPV1電流。實驗中采用EPC-10膜片鉗放大器和Patch master軟件來記錄和分析DRG神經(jīng)元的電活動。

2 結果

2.1 徐長卿丹皮酚對骨癌痛大鼠痛行為的影響大鼠造模后d 14測定大鼠機械痛閾和熱痛閾，d 15腹腔注射不同濃度的Paeonol，連續(xù)給藥3 d后，再次測定大鼠的機械痛閾和熱痛閾。實驗結果顯示，Paeonol能明顯提高骨癌痛大鼠的機械痛閾和熱輻射痛閾，并且具有劑量依賴性(Fig 1)。

2.2 徐長卿丹皮酚對骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元興奮性的影響以往的研究表明，骨癌痛大鼠的DRG神經(jīng)元興奮性會明顯增強，這也是骨癌痛的外周敏化機制[10]。因此，本研究首先急性分離給藥3 d后的骨癌痛大鼠的DRG神經(jīng)元，然后采用膜片鉗技術記錄DRG神經(jīng)元的電生理參數(shù)。結果表明，Paeonol(100 mg·kg-1)能明顯增加骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元靜息膜電位的絕對值，上調(diào)骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元誘發(fā)動作電位的去極化電流閾值、動作電位爆發(fā)的閾值(Fig 2)。同樣，Paeonol(100 mg·kg-1)也能降低300 pA去極化電流誘發(fā)的DRG神經(jīng)元動作電位發(fā)放的頻率(Fig 3)。這些結果表明，Paeonol能降低骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元的興奮性。

Fig 1 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatum on development of bone cancer pain of ratsNote that Paeonol of Cynanchum paniculatum could increase both the paw withdrawal threshold；(A) paw withdrawal latency (B) in a dose-dependent manner in bone cancer pain rats. n=8).*P<0.05, **P<0.01 vs normal saline group

2.3 徐長卿丹皮酚對骨癌痛大鼠DRG上TRPV1蛋白表達的影響大量研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1在骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元上的表達明顯上調(diào)，并且介導了DRG神經(jīng)元的興奮性和骨癌痛的發(fā)生[1, 11]，因此本研究檢測了Paeonol(100 mg·kg-1)對骨癌痛大鼠DRG上TRPV1總蛋白和膜蛋白表達的影響，實驗結果顯示，連續(xù)給藥3 d后，Paeonol能夠明顯抑制骨癌痛大鼠DRG上TRPV1總蛋白和膜蛋白的表達(Fig 4)，這提示Paeonol很可能是通過下調(diào)TRPV1蛋白的表達進而抑制神經(jīng)元興奮性和骨癌痛的發(fā)生。

Fig 2 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatum on DRG neurons hyperexcitability in bone cancer pain of ratsA： Representative of the first action potential evoked by depolarizing current pulse recorded from the DRG neurons；B： Paeonol of Cynanchum paniculatum reversed bone cancer-induced the decrease of the absolute values of resting membrane potential(RMP) in bone cancer pain rats； C： Bone cancer-induced the decreased values of current threshold (CT) was reversed by Paeonol of Cynanchum paniculatum； D： Paeonol of Cynanchum paniculatum attenuated the increased absolute values of threshold potential (TP) induced by bone cancer pain. n=25-26)*P<0.05, **P<0.01 vs Normal, #P<0.05, ##P<0.01 vs Normal saline.

Fig 3 Numbers of AP in DRG neurons decreased by Paeonol of Cynanchum paniculatum in bone cancer pain of ratsA： Representative of evoked discharges by a-500 ms, 300 pA depolarizing current pulse； B： Analysis of the evoked AP numbers. Note that the number of the evoked AP was significantly reduced in Paeonol-treated group. n=24-26) **P<0.01 vs Normal, ##P<0.01 vs NS (Normal saline).

2.4 徐長卿丹皮酚對骨癌痛大鼠DRG上TRPV1電流的影響Paeonol對TRPV1功能的影響尚不清楚，因此本研究采用膜片鉗技術記錄了TRPV1電流的變化。實驗結果顯示，連續(xù)3 d給予Paeonol(100 mg·kg-1)后，骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元上TRPV1的電流密度也明顯降低(Fig 5)。

Fig 5 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatumon TRPV1 currents in DRG neurons in bone cancer pain ratsA： Representative currents evoked by application of capsaicin (0.5 μmol·L-1 for 3 seconds) to DRG neurons in rats； B： Paeonol of Cynanchum paniculatum significantly decreased TRPV1 currents in DRG neurons in bone cancer pain rats. n=20) **P<0.01 vs Normal, ##P<0.01 vs NS (Normal saline), 1-way ANOVA.

Fig 4 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatum on protein expression of TRPV1 in DRGs in bone cancer of rats Note that Paeonol of Cynanchum paniculatum reversed bone cancer-induced the up-regulation of TRPV1 total protein (A) and membrane protein (B) expression. β-actin and TfR (transferrin receptor) was used as an internal control. n=6) **P<0.01 vs Normal, ##P<0.01 vs Normal saline.

3 討論

徐長卿味辛、性溫，無毒，歸肝、腎經(jīng)，臨床上常用于各種痛癥的治療，例如徐長卿內(nèi)服或外用在治療牙痛、胃痛、腹痛、風濕性關節(jié)痛、痛經(jīng)等方面有良好的止痛效果，但到目前為止還沒有文獻對徐長卿發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的成分和作用機制進行報道。本研究中，我們首次證明Paeonol可以通過下調(diào)TRPV1的表達進而抑制神經(jīng)元的興奮性，從而治療骨癌痛。

然而，我們并沒有探討Paeonol下調(diào)TRPV1表達的機制，有文獻報道，丹皮酚具有抗炎、抗氧化的作用[12]，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)，丹皮酚可以抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達[14-15]，而TNF-α、IL-6可以通過MEK/ERK、PI3K/AKT等多條信號通路上調(diào)TRPV1蛋白的表達和功能的敏化，并且在骨癌痛的發(fā)生發(fā)展過程中，這些炎癥因子的表達也明顯上調(diào)[11, 15]，因此我們推測Paeonol很可能是通過抑制炎癥反應，進而抑制TRPV1蛋白表達和功能的敏化。

除了TRPV1受體，在外周DRG神經(jīng)元上還有很多受體或離子通道參與了骨癌痛的外周敏化，例如Nav1.8通道及KCNQ通道等[16]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)使用Paeonol后，DRG神經(jīng)元膜電位絕對值增大，而TRPV1對細胞膜電位影響并不明顯，因此我們推測Paeonol也可能會通過調(diào)節(jié)Nav1.8通道及KCNQ通道的表達或功能進而發(fā)揮抗骨癌痛的作用，當然這些假說還需要實驗驗證。