張鶴山 ，王志勇，陳志宏，熊軍波，田 宏，陸嬌云，劉 洋*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064；2.信陽農(nóng)林學院園藝學院，河南信陽 464000；3.全國畜牧總站，北京 100125）

【研究意義】紅三葉（Trifolium pratenseL.）是世界上栽培最為廣泛的豆科牧草之一[1]，我國西北部、西南部及長江流域進行大面積栽培利用。據(jù)統(tǒng)計，2017 年我國主要紅三葉栽培地區(qū)甘肅紅三葉栽培面積3.61萬hm2，湖北3萬hm2，重慶5.6萬hm2[2]，湖北省僅巴東地區(qū)就分布有7萬余hm2紅三葉人工草地[3]。紅三葉在我國高海拔地區(qū)與黑麥草（Lolium perenneL.）、葦狀羊茅（Festuca arundinaceaSchreb.）等禾草混種可建成優(yōu)良人工草地，在四川、貴州、湖北等地與玉米等作物間作，改良土壤，提高作物產(chǎn)量，供作優(yōu)良綠肥，為當?shù)夭莸匦竽翗I(yè)生產(chǎn)發(fā)展和增加農(nóng)牧民經(jīng)濟收入發(fā)揮了重要作用。除此之外，紅三葉在醫(yī)藥及保健品領(lǐng)域亦被開發(fā)利用[4-6]。紅三葉起源于地中海地區(qū)，但在世界各地均有分布，并適合多種土壤氣候條件[7]，我國新疆、貴州、云南等地有野生（逸生）資源分布。紅三葉的這種廣泛適應性主要是由于物種本身擁有許多適應當?shù)丨h(huán)境條件的基因型[8]。實際上，紅三葉是異花授粉植物，存在配子體自交不親和現(xiàn)象，使得群體內(nèi)或群體間具有顯著的性狀差異，這種差異也為紅三葉育種親本材料的選擇提供機會[9]。我國目前登記的“巴東”、“岷山”、“巫溪”和“貴州”等4個紅三葉品種就是由地方資源經(jīng)選擇培育而成的。因此，對紅三葉種質(zhì)表觀性狀變異的分析是進一步利用紅三葉種質(zhì)的基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】植物的表型性狀是植物內(nèi)在組織生長分化的外在表現(xiàn)，是植物適應環(huán)境變異最直接的體現(xiàn)[10]，也是檢測遺傳變異和多樣性的最直接簡便的方法[11]。國內(nèi)外學者對紅三葉品種間或群體內(nèi)的表觀性狀變異及多樣性進行了許多研究。Bulinska-Radomska 等[12]利用21個表觀性狀分析了三個草屬15個種的變異關(guān)系，發(fā)現(xiàn)種間差異水平在0.05～0.60；Greene 等[13]利用15 個表觀性狀對33 個紅三葉種質(zhì)材料進行了變異分析，發(fā)現(xiàn)14 個性狀在不同材料間具有顯著差異；Paula等[9]利用17個表觀性狀對大田和溫室的57份紅三葉栽培或野生材料進行表觀性狀變異分析，表明材料間具有比較大的性狀變異，并以花期將材料劃分為不同的5個類群。在國內(nèi)，張鶴山[3]對湖北地區(qū)的25個野生紅三葉群體間和群體內(nèi)11個表觀性狀進行了變異分析，變異系數(shù)范圍為5.93%～34.57%；王建麗[14]對20份引進紅三葉資源的9個生長方面的農(nóng)藝性狀進行了變異分析，發(fā)現(xiàn)頂生葉片大小變異系數(shù)最大，為26.16%。這些研究都表明紅三葉無論群體間還是群體內(nèi)都存在較大的性狀變異和豐富的群體遺傳多樣性?！颈狙芯壳腥朦c】表觀性狀變異分析是進行遺傳多樣性分析、篩選優(yōu)良種質(zhì)資源的有效措施。我國生產(chǎn)中使用的紅三葉品種主要來自國外，由于地域差異，引進種質(zhì)有時會表現(xiàn)出優(yōu)異的特性。如何篩選出優(yōu)異種質(zhì)材料用于紅三葉育種是亟需解決的問題。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬對紅三葉表觀性狀的變異進行研究，并對種質(zhì)材料進行聚類分析，旨在篩選有利用價值的種質(zhì)材料，為紅三葉育種提供基礎(chǔ)親本材料和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在2018 年進行。試驗材料為來自國內(nèi)外的45 份紅三葉種質(zhì)，由全國畜牧總站提供，材料信息見表1。

表1 紅三葉材料來源信息Tab.1 Information on origin of red clover

1.2 試驗方法

采用隨機區(qū)組設計，每個材料3個重復小區(qū)，每個小區(qū)種植30株，行距50 cm，株距60 cm。所有材料在2016年秋季種植，各性狀在植株生長第3年時測定。

試驗地點位于武漢市江夏區(qū)牧草種質(zhì)資源圃，地理位置東經(jīng)114°10′，北緯30°18′，海拔31 m，屬亞熱帶北緣季風氣候，光照充足，熱量豐富，雨水充沛，年平均溫度16.7 ℃，年降水量1 200 mm左右，無霜期270 d；該地區(qū)為丘陵崗地，土壤類型為丘陵黃土，酸性；土壤有機質(zhì)含量1.8%，pH 值5.69，速效氮、磷、鉀的含量分別為88.2 mg/kg、22 mg/kg和87 mg/kg。

1.3 測定項目與方法

測定方法參照《三葉草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[17]執(zhí)行，具體指標及方法如下：

莖長度：在開花期，以整個小區(qū)植株為觀測對象，隨機抽取開花的植株10株，測量植株主莖長度，單位為cm。

莖分枝：在開花期，以整個小區(qū)植株為觀測對象，隨機抽取開花的植株10株，采用目測法計數(shù)每個植株主莖分枝的數(shù)目，單位為枝/株。

莖節(jié)數(shù)：在開花期，以整個小區(qū)植株為觀測對象，隨機抽取開花的植株10株，采用目測方法觀測植株主莖第一個節(jié)到主莖末梢的節(jié)數(shù)，單位為節(jié)。

莖節(jié)長度：在開花期，以整個小區(qū)植株為觀測對象，隨機抽取開花的植株10株，測量主莖第四個節(jié)間的長度，單位為cm。

莖直徑：在開花期，以整個小區(qū)植株為觀測對象，隨機抽取開花的植株10株，卡尺測量主莖第四個節(jié)間的直徑，單位為cm。

頂生葉片長度：在開花期，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機抽取開花的植株10 株，分別測量每一株中部頂生小葉從葉頸至葉尖的絕對長度，單位為cm。

頂生葉片寬度：在開花期，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機抽取開花的植株10 株，分別測量每一株中部頂生小葉最寬處的絕對長度，單位為cm。

側(cè)生葉片長度：在開花期，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機抽取開花的植株10 株，分別測量每一株中部側(cè)生小葉從葉頸至葉尖的絕對長度，單位為cm；

側(cè)生葉片寬度：在開花期，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機抽取開花的植株10 株，分別測量每一株中部側(cè)生小葉最寬處的絕對長度，單位為cm。

葉形指數(shù)：頂生小葉長度與頂生小葉寬度的比值。

葉柄長度：在開花期，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機抽取開花的植株10 株，分別測量每一株中部葉柄的長度，單位為cm。

葉柄直徑：在開花期，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機抽取開花的植株10 株，分別測量每一株中部葉柄中間部位的直徑，單位為mm。

單株花序數(shù)：在盛花期，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機抽取開花植株10 株，采用目測法觀測計數(shù)每株上的花序數(shù)，單位為個。

每花序小花數(shù)：在盛花期，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機選取主莖從上往下數(shù)第二個節(jié)上的花序10 個，計數(shù)花序上的小花數(shù)，單位為朵。

花序長度：在盛花期，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機抽取開花植株10株，測量花序的長度，單位為cm。

花序?qū)挾龋涸谑⒒ㄆ?，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機抽取開花植株10 株，測量花序最寬處的直徑，單位為cm。

種子長度：采集風干后成熟干籽粒為觀測對象，隨機抽取10粒干種子，測量最長處的長度，單位為mm。

種子寬度：采集風干后成熟干籽粒為觀測對象，隨機抽取10粒干種子，測量最寬處的長度，單位為mm。

種子千粒質(zhì)量：采集風干后成熟干籽粒為觀測對象，隨機取樣，4 次重復，每個重復1 000 粒種子，用1/1000天平稱量，單位為g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 軟件計算各性狀平均值、標準差和變異系數(shù)；用SPSS 軟件進行方差分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表觀性狀變異分析

2.1.1 群體間性狀變異 45份紅三葉種質(zhì)材料的19個表觀性狀變異情況見表2。所有性狀在群體間均產(chǎn)生了不同程度的遺傳分化，變異系數(shù)范圍為6.65%～20.57%。其中，莖節(jié)長度在不同材料群體間具有最大程度的分化，變化范圍為3.1～4.3 cm，平均值10.2 cm，變異系數(shù)為20.57%；其次為單株花序數(shù)，變異系數(shù)為20.41%，指標變幅為75～136朵；分化程度最小的性狀是頂生葉片長度，變異系數(shù)僅為6.65%，其次為頂生葉片寬度，變異系數(shù)6.72%。經(jīng)方差分析（F 檢測），19 個表觀性狀在不同群體間的差異均達到顯著水平（P<0.05），其中12 個性狀（莖長度、莖分枝、莖節(jié)數(shù)、莖節(jié)長度、莖直徑、側(cè)生葉片寬、葉柄長度、葉柄直徑、單株花序數(shù)、花序小花數(shù)、花序長度以及種子寬度）的變異系數(shù)均超過10%，也即說明這些性狀在紅三葉不同群體間具有較大程度的變異。因此，為了更有效地研究紅三葉種質(zhì)的多樣性，以這12個性狀數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)對后續(xù)的相關(guān)性、聚類以及主成分進行分析。

表2 紅三葉群體間及群體內(nèi)性狀變異分析Tab.2 Analysis of variance for all morphological traits of red clover

2.1.2 群體內(nèi)性狀變異 紅三葉種質(zhì)群體內(nèi)各性狀均具有顯著的變異分化。為研究紅三葉種質(zhì)群體內(nèi)的性狀分化程度，隨機選擇兩個種質(zhì)為例進行性狀變異分析（CF0022184 和CF022236），結(jié)果見表2。兩個種質(zhì)群體內(nèi)各性狀均具有不同程度的變異，變異系數(shù)范圍分別為3.98%～29.41%和1.99%～31.58%且差異達到顯著水平（P<0.05）。種質(zhì)CF022184 群體內(nèi)性狀分化程度最大的是單株花序數(shù)，變異系數(shù)為29.41%，其次為莖節(jié)數(shù)，變異系數(shù)為24.14%；變異系數(shù)最小的是種子千粒質(zhì)量，僅為3.98%。19個性狀中有11 個性狀變異系數(shù)大于10%。種質(zhì)CF022236 群體內(nèi)變異系數(shù)最大的是葉柄長度，變異系數(shù)為31.58%，其次為莖直徑（22.89%）；莖長度、莖分枝等14 個性狀變異系數(shù)大于10%，說明該群體內(nèi)存在廣泛的性狀變異。在兩個種質(zhì)內(nèi)，變異程度最低的性狀都為種子千粒質(zhì)量，這與張鶴山等[3]對湖北地區(qū)野生紅三葉種質(zhì)研究結(jié)果一致。

2.2 表觀性狀間相關(guān)性分析

基于材料間變異系數(shù)大于10%的12 個性狀指標分析了各性狀間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果見表3。不同表觀性狀間具有不同程度的正向或負向相關(guān)性。莖長度與莖節(jié)數(shù)和葉柄長度呈顯著正相關(guān)（P<0.05），說明紅三葉株高（莖長度）越高，其莖節(jié)數(shù)越多、葉柄越長。莖分枝與其他性狀有正或負相關(guān)性，但均沒有達到顯著水平。莖節(jié)數(shù)和葉柄長度及葉柄直徑具有極顯著正相關(guān)；莖節(jié)長度和花序小花數(shù)及莖直徑呈顯著正相關(guān)，但與葉柄直徑顯著負相關(guān)；葉柄長度與花序小花數(shù)呈顯著正相關(guān)；而種子寬度與花序長度具有顯著正相關(guān)關(guān)系，說明花序越長，種子越寬。

表3 45份紅三葉材料表觀性狀間遺傳相似系數(shù)Tab.3 Genetic similarity coefficient between traits in 45 populations of red clover

2.3 聚類分析

聚類分析表明，在歐式距離15.0 處可將45 份紅三葉種質(zhì)資源分為4 個類群（圖1）。第I 類群包括34 份種質(zhì)，幾乎囊括所有來源國的紅三葉材料，來自中國的3 份紅三葉種質(zhì)包含在這一類群中；第II 類群包含4份種質(zhì)，來自匈牙利、俄羅斯、羅馬尼亞、英國4個不同的國家；第III類群有4份種質(zhì)，來自美國、英國、匈牙利3個國家；第VI類群包括3份種質(zhì)，來自美國、英國和捷克斯洛伐克?？梢钥闯?，基于12個表觀性狀的聚類分析并沒有將同一地區(qū)的種質(zhì)聚在同一個類群，表明了紅三葉種質(zhì)材料豐富的形態(tài)多樣性。

圖1 基于表觀性狀的45份紅三葉遺傳距離Fig.1 Genetic distance among 45 red clover populations based on morphological data

各類群表觀性狀特征見表4。相較于其他類群，第I 類群種質(zhì)表觀性狀指標處于平均水平，植株偏矮，單株花序數(shù)和單花序小花數(shù)較多分別達到107個和115朵，種子生產(chǎn)潛力較大；第II類群種質(zhì)特征為植株高大、葉片大、花序多，其平均莖長度為92.9 cm，平均側(cè)生小葉寬度2.7 cm，單株花序數(shù)為118個/株，種子寬度為1.24 mm，說明了該類群種質(zhì)具有較高的地上生物產(chǎn)量和種子生產(chǎn)性能；第III類群整體形態(tài)特征為植株高，單株分枝能力強；第VI 類群表觀特征較為明顯，屬于植株矮小的一類，平均莖長度僅為57.3 cm，并且單株花序數(shù)和花序小花數(shù)均較低，說明其牧草生產(chǎn)和種子生產(chǎn)潛力價值較低。

表4 紅三葉種質(zhì)每個類群表觀性狀的平均值Tab.4 Mean of morphological traits in each cluster obtained in a subset of populations of red clover germplasm

3 討論

紅三葉為配子體自交不親和植物，其群體間或群體內(nèi)存在較大的性狀變異分化潛力，這些具有不同特征的種質(zhì)材料為紅三葉育種工作提供了豐富的原始親本材料，是品種選育工作的基礎(chǔ)。結(jié)果表明，45 份紅三葉群體間和群體內(nèi)都存在大的表觀性狀變異，這與前人研究結(jié)果一致[3,14,18-19]。但是，具體在表觀性狀上，同一性狀在不同材料間的變異程度大小是不一樣的。試驗結(jié)果表明，紅三葉群體間變異分化最大的性狀是莖節(jié)長度和單株花序數(shù)，變異系數(shù)分別為20.57%和20.41%，這與他人研究結(jié)果有所不同。王建麗等[14]對來自俄羅斯的20 份紅三葉表觀性狀分析證明頂生小葉大小性狀變異程度最大，而孟麗娟等[19]發(fā)現(xiàn)紅三葉不同種質(zhì)間葉面積分化程度最大。由此可見，紅三葉種質(zhì)間的變異大小不僅與材料有關(guān)，還可能受生長環(huán)境和生態(tài)區(qū)域的影響。

表觀性狀評價是紅三葉種質(zhì)資源篩選的重要依據(jù)[20]，但紅三葉表觀形態(tài)性狀復雜多樣，為其評價工作帶來難度。前人研究表明，紅三葉植株葉面積和開花期具有較高的正相關(guān)性，葉片越大，開花期越晚[22]，但單株花序數(shù)與其他性狀并沒有顯著相關(guān)性[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)莖長度和莖節(jié)數(shù)、葉柄長度呈顯著正相關(guān)，但單株花序數(shù)與其他表觀性狀不具顯著相關(guān)性。

通過表觀性狀可以有效地將具有同一性狀屬性的紅三葉種質(zhì)聚為一類，許多研究也證明了這種方法的有效性[13,22]。本研究以12個表觀性狀將45份紅三葉種質(zhì)資源劃分為4個類群，每個類群具有明顯差異的形態(tài)特征，如第II 類群種質(zhì)其植株高大、單株花序數(shù)多，第III 類群種質(zhì)具有更強的單株分枝能力。研究表明，單株花序數(shù)和單株莖分枝數(shù)是影響紅三葉種子生產(chǎn)的重要因子[15,23]，因此本研究結(jié)果可以為高種子產(chǎn)量紅三葉品種選育提供幫助。盡管通過聚類分析可將具有相近表觀性狀的紅三葉種質(zhì)材料劃分到同一個類群，但就種質(zhì)來源地而言，來自同一地域的種質(zhì)材料并未被聚在同一或相近的類群。實際上，這種現(xiàn)象在異花授粉植物如紫花苜蓿（Medicago sativa）[21]和紅三葉（Trifolium pratense）[9]中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。一方面，可能是因為選育過程中大多采用綜合品種的方法，無論地方品種還是自然材料，其種質(zhì)為許多雜合單株組成混合群體[24]；另一方面，異花授粉的特性也會引起個體差異大于品種間差異的現(xiàn)象，抵消了來源地生態(tài)環(huán)境的影響[19]。聚類分析能夠突出同類的特點和異類之間的差異，在紅三葉育種和生產(chǎn)中，可以根據(jù)育種目標選擇相應特點的親本材料，減少育種過程中的盲目性，提高育種效率。

4 結(jié)論

紅三葉種質(zhì)無論群體間還是群體內(nèi)都存在較大程度的表觀性狀變異分化，莖節(jié)長度在各群體間的變異系數(shù)最大，為20.57%，而頂生葉片長度變異分化程度最小，變異系數(shù)僅為6.65%。紅三葉株高（莖長度）越高，其莖節(jié)數(shù)越多、葉柄越長；莖節(jié)長度和花序小花數(shù)及莖直徑呈顯著正相關(guān)，而種子寬度與花序長度具有顯著正相關(guān)關(guān)系。45份紅三葉種質(zhì)材料根據(jù)植株形態(tài)可劃分為4個類群，第I類群包含34個種質(zhì)，占所有種質(zhì)的75%，其表觀特征為植株高度中等，種子生產(chǎn)潛力較大；第II類群和第III類群均包含4個種質(zhì)，其特征是植株高大，具有較高的地上生物產(chǎn)量生產(chǎn)能力；第VI類群包括3個種質(zhì)，其明顯特征是植株低矮，平均株高57.3 cm。可見，種質(zhì)材料間具有顯著的群體特征和性狀差異，可為紅三葉育種和生產(chǎn)提供科學參考。