陳亞寧，吳鋆龍，徐 利，葛鳳菊，祁秀娟，黃 亞

(上海永遠(yuǎn)幸婦科醫(yī)院生殖中心，上海 200131)

近年來，隨著我國(guó)社會(huì)環(huán)境的變化及人們生活習(xí)慣的改變，不孕人群比例逐年增加[1]，越來越多的不孕患者需要借助輔助生殖技術(shù)進(jìn)行助孕治療。因此，在臨床治療過程中如何選擇合適的促排卵方案提高患者的促排卵效率和卵子利用率，增加優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，改善臨床妊娠結(jié)局是當(dāng)今生殖醫(yī)學(xué)討論的熱點(diǎn)問題。目前，臨床上應(yīng)用的促排卵方案很多，不同方案各有優(yōu)劣,適合不同患者人群。對(duì)于年齡偏大和卵巢儲(chǔ)備功能較差的患者，克羅米芬(CC)促排卵和卵泡期高孕激素狀態(tài)下促排卵(PPOS)是近年來應(yīng)用較多的促排卵方案[2-4]。目前，以上兩種方案在全國(guó)的應(yīng)用也較為普遍，相關(guān)研究報(bào)道也在逐年增加，但是，兩種促排卵方案對(duì)卵子紡錘體相關(guān)參數(shù)的影響尚少見報(bào)道。本院應(yīng)用較多的促排卵方案為PPOS方案和CC促排卵方案。為探討PPOS方案和CC促排卵方案對(duì)卵子紡錘體參數(shù)及胚胎發(fā)育的影響，本研究對(duì)本院就診患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2019年8月在本院行卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)[ICSI指征：男性因素及前次體外受精(IVF)完全失敗或受精率低于30%]助孕治療患者356例作為研究對(duì)象，將入選的356例患者分為PPOS組226例，平均年齡(36.60±5.15)歲；CC組130例，平均年齡(36.17±5.73)歲，兩組患者精液來源差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn) 采用PPOS方案或CC微刺激方案促排卵，行ICSI的MⅡ期卵母細(xì)胞紡錘體觀察。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) (1)重度宮腔粘連及子宮內(nèi)膜異位癥患者；(2)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及反復(fù)種植失敗者；(3)存在內(nèi)、外科基礎(chǔ)疾病且不能耐受妊娠者；(4)男方梗阻性無精子癥或極重度少、弱、畸精子癥，經(jīng)皮睪丸/附睪穿刺取精的患者；(5)卵子成熟障礙及各種原因行卵子激活的患者。

1.3研究方法

1.3.1基礎(chǔ)激素水平檢測(cè) 于月經(jīng)周期第3天檢測(cè)患者基礎(chǔ)激素水平?？箍娎展芗に?AMH)采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)(E602，Roche，瑞士)；卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)和孕酮(P)均采用熒光磁微粒酶免法檢測(cè)(AIA2000，TOSOH，日本)。

1.3.2促排卵方案 (1)PPOS方案：于月經(jīng)周期第3天開始口服醋酸甲羥孕酮(MPA，浙江仙琚制藥股份有限公司)10 mg/d至扳機(jī)前一日；同時(shí)肌肉注射尿促性素(HMG，珠海麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司)150～225 U/d。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm時(shí)皮下注射醋酸曲普瑞林(輝凌制藥有限公司)0.1 mg扳機(jī)，34～36 h后取卵。(2)CC促排卵方案：采用CC+HMG促排卵方案。于月經(jīng)周期第3天開始口服CC膠囊(高特制藥有限公司)50 mg/d至扳機(jī)前一日；周期第8天開始，肌肉注射HMG 75～150 U/d，隔日一次。當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm時(shí)皮下注射醋酸曲普瑞林(達(dá)必佳，輝凌制藥)0.1 mg扳機(jī)，34～36 h后取卵。

1.3.3取卵和精液優(yōu)化處理 B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵，將獲得的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h，然后用透明質(zhì)酸酶消化去除卵子周圍的顆粒細(xì)胞，將成熟卵子轉(zhuǎn)移至受精液(SAGE，美國(guó))中待用。精液來源于手淫取精的新鮮精液，采用PureCeption(SAGE，美國(guó))密度梯度離心法處理，處理后的精液置于室溫，待用。

1.3.4紡錘體觀察和ICSI授精 將卵裂皿中的成熟卵子轉(zhuǎn)移至ICSI操作皿(NIPRO，日本)中，使用Oosight紡錘體成像系統(tǒng)(HAMILTON THORNE，美國(guó))進(jìn)行觀察：在Live Oosight模式下扣除背景，然后拍攝卵母細(xì)胞紡錘體的圖像，拍攝后將紡錘體置于12：00位置，從3:00位置進(jìn)針，進(jìn)行ICSI操作，注射完成后將卵子按順序轉(zhuǎn)入新的卵裂液微滴中，置于三氣培養(yǎng)箱(KITAZATO，日本)中單胚胎培養(yǎng)。然后利用Oosight Meta軟件測(cè)量紡錘體的長(zhǎng)軸和短軸、紡錘體與極體的夾角及紡錘體的光阻滯值。

1.3.5受精觀察及優(yōu)胚評(píng)價(jià) ICSI后16～20 h觀察受精情況，統(tǒng)計(jì)單原核(1PN)、雙原核(2PN)、多原核(≥3PN)和無原核(0PN)卵裂的卵子數(shù)為受精數(shù)，其中2PN為正常受精。受精率=受精數(shù)/行授精數(shù)×100%；正常受精率=正常受精數(shù)/行授精數(shù)×100%。優(yōu)胚是指正常受精來源且第3天為Ⅰ、Ⅱ級(jí)的胚胎，而Ⅲ、Ⅳ級(jí)的胚胎常規(guī)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。優(yōu)胚率=優(yōu)胚數(shù)/正常受精卵裂數(shù)×100%；囊胚形成率=Ⅱ級(jí)及Ⅱ級(jí)以上囊胚數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%。

1.3.6凍融胚胎移植(FET) 內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和黃體支持：統(tǒng)一采用激素替代周期方案進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備。從月經(jīng)第10天起B(yǎng)超觀察子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)，當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，解凍胚胎行單胚胎移植，移植后常規(guī)黃體支持治療。移植后14 d檢測(cè)血清人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)水平，β-HCG陽性者判定為生化妊娠，移植后30 d行B超檢查，宮腔內(nèi)見到孕囊及原始心血管搏動(dòng)者判定為臨床妊娠。

1.4觀察指標(biāo) 比較兩組患者平均年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、行授精數(shù)、AMH水平及基礎(chǔ)內(nèi)分泌激素水平、促性腺激素(Gn)應(yīng)用時(shí)間、Gn用量、紡錘體體積、紡錘體與極體的夾角、紡錘體光阻滯值、受精率、正常受精率、優(yōu)胚率、囊胚形成率和臨床妊娠率。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般情況比較 PPOS組與CC組平均年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、行授精數(shù)、AMH水平及FSH、LH、E2和P水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CC組Gn應(yīng)用時(shí)間和Gn用量均明顯低于PPOS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般情況比較

組別不孕年限(年)獲卵數(shù)(枚)行授精數(shù)(枚)Gn應(yīng)用時(shí)間(d)Gn用量(U)PPOS組5.10±3.952.33±0.152.28±1.687.03±3.041 110.07±580.49CC組4.83±3.552.36±0.212.32±1.575.05±3.13781.78±578.92t0.6540.8980.2195.4374.776P0.514 0.370 0.827 <0.001 <0.001

2.2兩組卵母細(xì)胞紡錘體參數(shù)比較 PPOS組患者卵子紡錘體體積、紡錘體與極體的夾角及紡錘體的光阻滯值與CC組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組卵母細(xì)胞紡錘體參數(shù)比較

2.3胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局 PPOS組受精率、正常受精率、優(yōu)胚率和囊胚形成率與CC組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。其中PPOS組534枚卵子，CC組312枚卵子。兩種促排卵方案進(jìn)行胚胎移植患者平均年齡和內(nèi)膜厚度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CC組卵裂期FET臨床妊娠率明顯高于PPOS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，囊胚期FET臨床妊娠率雖然高于PPOS組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。其中卵裂期行FET的患者數(shù)為PPOS組144例，CC組65例；囊胚期行FET的患者數(shù)為PPOS組18例，CC組16例。

表3 兩組胚胎發(fā)育情況比較[%(n/n)]

表4 兩組FET臨床妊娠結(jié)局比較

3 討 論

近年來，隨著女性生育年齡的不斷推后，以及國(guó)家二孩政策的全面放開，接受助孕治療的夫婦越來越多，患者平均年齡也越來越大。選用合適的促排卵方案提高卵巢儲(chǔ)備功能差的患者的助孕效果、改善臨床妊娠結(jié)局顯得尤為重要。本研究對(duì)來本院就診的應(yīng)用PPOS方案和CC促排卵方案行ICSI助孕的患者進(jìn)行研究，對(duì)患者一般情況進(jìn)行比較分析顯示，兩組患者平均年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、行授精數(shù)、AMH水平及FSH、LH、E2和P水平等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CC組Gn應(yīng)用時(shí)間和Gn用量均明顯低于PPOS組，與以往眾多研究的用藥情況一致[5]。

ICSI應(yīng)用Oosight紡錘體成像系統(tǒng)(HAMILTON THORNE，美國(guó))對(duì)卵子紡錘體的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量[6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組卵子紡錘體相關(guān)參數(shù)(包括紡錘體體積、紡錘體與極體的夾角及紡錘體的光阻滯值等)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，初步推測(cè)這兩種促排卵方案對(duì)卵子紡錘體參數(shù)的影響無明顯差異。目前已有許多關(guān)于紡錘體有無、紡錘體大小、紡錘體與極體的夾角及紡錘體光阻滯值的研究[7-10]，但少見促排卵方案對(duì)紡錘體參數(shù)影響的研究。本研究結(jié)果顯示，PPOS方案和CC促排卵方案對(duì)紡錘體參數(shù)的影響無明顯差異，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，深入探討促排卵方案與紡錘體參數(shù)之間的關(guān)系。

本研究對(duì)兩種促排卵方案卵子的受精、胚胎發(fā)育情況及FET臨床妊娠結(jié)局進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，兩種促排卵方案卵子的受精率、正常受精率、優(yōu)胚率和囊胚形成率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有學(xué)者認(rèn)為，PPOS方案能很好地抑制早發(fā)LH峰，從而獲得更高的優(yōu)胚率[11-12]。HUANG等[13]的研究顯示，PPOS組的優(yōu)胚率高于CC組，而本研究中PPOS組的優(yōu)胚率略高于CC組，差異不明顯。優(yōu)胚是對(duì)發(fā)育至第3天的胚胎進(jìn)行的評(píng)價(jià)，單憑形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)的第3天優(yōu)胚率還不能很好地預(yù)測(cè)胚胎的后續(xù)發(fā)育潛能。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)胚胎發(fā)育后期的囊胚形成率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，常規(guī)對(duì)第3天Ⅰ、Ⅱ級(jí)的優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍，而Ⅲ、Ⅳ級(jí)的胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，結(jié)果顯示，CC組的囊胚形成率高于PPOS組，但差異不明顯。兩種促排卵方案卵子的早期胚胎發(fā)育情況比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，本研究繼續(xù)追蹤了進(jìn)行FET患者的臨床妊娠結(jié)局。

FET患者統(tǒng)一采用激素替代周期方案進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備，然后進(jìn)行單胚胎解凍移植。本研究對(duì)卵裂期和囊胚期的胚胎分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組移植患者平均年齡和移植日內(nèi)膜情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，臨床結(jié)局顯示，CC組卵裂期胚胎FET的臨床妊娠率明顯高于PPOS組，而囊胚期FET的臨床妊娠率雖有增高，但無差異。由于目前進(jìn)行囊胚期FET的患者數(shù)量較少(PPOS組18例、CC組16例)，所以囊胚期FET臨床妊娠率的比較還需要繼續(xù)隨訪。沈秀等[14]和LU等[15]的研究結(jié)果顯示，CC促排卵方案的FET臨床妊娠率高于PPOS方案。本研究中CC組優(yōu)胚率雖略低于PPOS組，但FET后的臨床妊娠率卻明顯高于PPOS組。由此推測(cè)，CC促排卵方案來源的胚胎與PPOS方案比較，在FET后的發(fā)育潛能和著床方面表現(xiàn)出更大優(yōu)勢(shì)。本研究推測(cè)可能與臨床促排卵過程中CC方案的Gn用量少和CC來源的胚胎整倍體率高有關(guān)。有研究證實(shí)，高劑量的Gn用量可能對(duì)胚胎發(fā)育潛能有影響[16]，后續(xù)計(jì)劃做這方面的比較。

4 結(jié) 論

綜上所述，PPOS和CC微刺激兩種促排卵方案對(duì)卵子紡錘體參數(shù)及早期胚胎發(fā)育的影響無差異。CC促排卵方案的卵裂期FET臨床妊娠結(jié)局明顯優(yōu)于PPOS方案。