陳見南，占劉英

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)中心/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，浙江杭州 310003)

過敏性紫癜(HSP)是兒童時期常見的一種以免疫復(fù)合物在受累組織小血管內(nèi)皮沉積為主要特征的、多種免疫介導(dǎo)的系統(tǒng)性免疫性血管炎，多累及皮膚、關(guān)節(jié)、消化道和腎臟，病因復(fù)雜，致病機(jī)制目前并不十分清楚[1-2]。目前大多認(rèn)為HSP的發(fā)病可能與感染、藥物、疫苗接種、食物過敏等因素有關(guān)。近年有較多研究報(bào)道HSP合并肺炎支原體(MP)感染病例，但尚缺乏確切證據(jù)證實(shí)MP感染可導(dǎo)致HSP。HSP發(fā)病誘因以感染占第1位，而MP感染誘發(fā)兒童HSP近年有增多趨勢[3]。本研究通過回顧性調(diào)查2016-2018年在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院進(jìn)行檢查的HSP-MP感染患兒、HSP患兒和健康體檢兒童的白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素-γ(IFN-γ)、CD4+、CD8+、CD3-CD16+CD56+、CD4+/CD8+水平，探討MP感染與HSP發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。此外，對HSP-MP感染組根據(jù)臨床特點(diǎn)和累積部位進(jìn)行臨床分型，觀察各型之間年齡和T細(xì)胞亞群水平的差異，為臨床及早判斷HSP的病情和預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016-2018年在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院住院的HSP急性期發(fā)作兒童作為研究對象，均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會制定的HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，所有患兒均為初次發(fā)病。起病在15 d以內(nèi)，既往身體健康，排除其他免疫性疾病。HSP-MP感染組101例，男49例，女52例；HSP組101例，男65例，女36例。另選取年齡、性別與HSP-MP感染組和HSP組相配的同期在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院健康體檢且資料齊全的59例兒童作為對照組，男32例，女27例。3組研究對象性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有HSP患兒均為急性期初發(fā)病例，近期(2周內(nèi))均未使用抗組胺藥物、腎上腺皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療。本研究通過浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家長均知情同意并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 (1)病原學(xué)診斷：德國Virion/Serion公司的MP-IgM試劑盒。(2)免疫功能檢測：儀器為美國BD公司 FACSCalibur型流式細(xì)胞分析儀，抗體及溶血素均為美國BD公司產(chǎn)品，試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3方法 (1)病原學(xué)診斷：HSP患兒于入院當(dāng)天未治療前采集靜脈血，取2 mL血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測，德國Virion/Serion公司的MP-IgM試劑盒，嚴(yán)格按說明書操作，檢測患兒MP-IgM水平。抗體效價>1∶80確診為陽性。(2)免疫功能檢測：①入院后治療前空腹抽取EDTA-K2抗凝血2 mL，采用流式細(xì)胞術(shù)測定T淋巴細(xì)胞亞群，由專人嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，檢測各組CD4+、CD8+、CD3-CD16+CD56+、CD4+/CD8+水平。②入院后治療前采集空腹靜脈血2 mL,3 000 r/min離心10 min,分離收集血清,置-20 ℃冰箱保存待測,采用ELISA雙抗體夾心法檢測上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF和IFN-γ水平，試劑盒購自深圳晶美有限公司，步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.13組外周血細(xì)胞因子水平比較 HSP-MP感染組、HSP組IL-2、IFN-γ水平均低于對照組,IL-4、TNF水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HSP-MP感染組IL-4水平高于HSP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HSP-MP感染組和HSP組IL-6和IL-10水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HSP組IL-6和IL-10水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HSP-MP感染組IL-2、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ水平與HSP組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.23組外周血淋巴細(xì)胞亞群水平比較 HSP-MP感染組、HSP組CD3-CD16+CD56+水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； HSP-MP感染組和HSP組CD4+、CD8+、CD3-CD16+CD56+和CD4+/CD8+水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HSP-MP感染組CD4+、CD8+、CD3-CD16+CD56+和CD4+/CD8+水平與HSP組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3HSP-MP感染組各臨床分型間年齡和淋巴細(xì)胞亞群水平比較 HSP-MP感染組101例患兒中，單純皮膚型13例，關(guān)節(jié)型36例，腹型16例，腎型8例，混合型28例。通過比較發(fā)現(xiàn)，腎型患兒年齡和CD8+水平均明顯高于單純皮膚型、關(guān)節(jié)型、腹型和混合型，CD4+/CD8+水平低于單純皮膚型、關(guān)節(jié)型、腹型和混合型，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腎型患兒CD4+水平與其他臨床分型比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3、圖1～4。

表1 3組外周血細(xì)胞因子水平比較[ M(P25～P75),pg/mL]

表2 3組外周血淋巴細(xì)胞亞群水平比較

表3 HSP-MP感染組各臨床分型間年齡和淋巴細(xì)胞亞群水平比較

圖1 HSP感染組各臨床分型間年齡比較(月)

圖2 HSP感染組各臨床分型間CD4+水平比較(%)

圖3 HSP感染組各臨床分型間CD8+水平比較(%)

圖4 HSP感染組各臨床分型間CD4+/CD8+水平比較

3 討 論

HSP是兒童時期常見的一種自身免疫性疾病，HSP患兒存在體液免疫紊亂、T細(xì)胞亞群功能失調(diào)及細(xì)胞因子分泌異常等多種免疫失衡，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚[5]。MP感染的HSP的發(fā)病機(jī)制也未明確，有研究顯示，HSP-MP感染較單純HSP 存在更為嚴(yán)重的T細(xì)胞功能紊亂[6]。本研究通過觀察外周血中細(xì)胞因子、T細(xì)胞亞群水平的變化，了解HSP患兒免疫功能狀態(tài)，探討MP 感染與HSP免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系；并通過比較HSP-MP感染患兒不同臨床分型間年齡和T細(xì)胞亞群水平的差異，為臨床及早對HSP進(jìn)行分型提供參考。

CD4+T淋巴細(xì)胞接受不同刺激后向不同的功能亞群分化，相應(yīng)的細(xì)胞因子在CD4+T淋巴細(xì)胞分化過程中起調(diào)控作用。IL-4主要由Th2輔助細(xì)胞分泌，參與體液免疫，促進(jìn)過敏反應(yīng)；IL-4對B細(xì)胞的增殖和抗體的產(chǎn)生特別是IgE的產(chǎn)生有巨大促進(jìn)和誘導(dǎo)功能；IL-2和IFN-γ主要由Th1輔助細(xì)胞分泌，參與細(xì)胞免疫，對抗細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌及原蟲的免疫反應(yīng)，在清除結(jié)核、麻風(fēng)等細(xì)胞內(nèi)寄生菌感染中發(fā)揮重要作用。如果Th1功能亢進(jìn)，將導(dǎo)致炎癥的慢性遷延、接觸性皮炎、自身免疫性疾病和器官移植急性排斥反應(yīng)等疾病的發(fā)生和病理損傷。CD4+T淋巴細(xì)胞分化過程中，Th1和Th2存在交互調(diào)節(jié)，作用相反的兩種細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡中發(fā)揮重要作用，高水平IL-4抑制CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1分化；而Th1通過IFN-γ抑制IL-4的分泌和CD4+T淋巴細(xì)胞向Th2分化。LI等[7]研究表明，HSP存在Th2功能亢進(jìn)，血清IL-4水平升高，而Th1和IFN-γ改變不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，HSP-MP感染患兒和HSP患兒IL-4水平升高，IL-2和IFN-γ水平下降，Th2優(yōu)勢活化，存在Th1/Th2失衡。此外，Th2類的細(xì)胞可產(chǎn)生IL-4等抗炎性的細(xì)胞因子，促進(jìn)抗體產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[8]。本研究HSP-MP感染患兒IL-4水平明顯高于HSP患兒，提示兒童HSP合并MP感染時可能存在Th2細(xì)胞分泌亢進(jìn)，體液免疫更加明顯。

TNF是由單核-巨噬細(xì)胞分泌的一種具有多種生物活性的多肽調(diào)節(jié)因子，屬于促炎因子，能有效反映腎臟受損程度，是檢測評估HSP持續(xù)性進(jìn)展的重要指標(biāo)，在HSP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[9]。本研究中HSP-MP感染患兒和HSP患兒TNF水平均升高，符合以往報(bào)道。而HSP-MP感染組和HSP組TNF水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明HSP患兒是否合并MP感染，TNF水平均會升高。

自然殺傷(NK)細(xì)胞即CD3-CD16+CD56+，是第三類群淋巴細(xì)胞，其特征性表型是CD16+和CD56+分子。測定CD3-CD16+CD56+水平可較準(zhǔn)確反映機(jī)體的免疫活性細(xì)胞狀態(tài)。魏樊[10]研究表明，HSP-MP感染患兒和HSP患兒的NK(CD3-CD16+CD56+)細(xì)胞水平均下降，且HSP-MP感染患兒NK(CD3-CD16+CD56+)細(xì)胞水平低于HSP患兒。還有文獻(xiàn)表明，HSP患兒CD3-、CD4+/CD8+水平均低于對照組[11-13]。本研究結(jié)果顯示，HSP-MP感染患兒和HSP患兒的NK(CD3-CD16+CD56+)細(xì)胞水平較對照組下降，二者與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明HSP患兒的細(xì)胞免疫活性降低。此外，由于 NK細(xì)胞對B細(xì)胞有一定的抑制作用，因此，NK細(xì)胞的活性降低使B細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致體液免疫亢進(jìn)。

HSP好發(fā)于兒童，本研究通過比較HSP-MP感染組不同臨床分型間中位年齡可發(fā)現(xiàn)，單純皮膚型中位年齡為83.6個月，關(guān)節(jié)型為83.8個月，腹型為84.5個月，混合型為73.7個月，腎型為105.8個月，腎型中位年齡明顯高于其他臨床分型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可以為臨床及早對HSP分型提供參考。通過比較HSP-MP感染組不同臨床分型間CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平發(fā)現(xiàn)，腎型CD8+水平明顯高于其他臨床分型,CD4+/CD8+低于其他臨床分型。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，與健康人比較，HSP患者CD4+水平降低，而CD8+水平升高[14]，CD4+/CD8+水平下降，由此提示在HSP患者急性期體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群功能處于紊亂狀態(tài)，同時也說明CD4+、 CD8+T細(xì)胞參與了HSP的發(fā)病過程。 本研究中腎型CD8+水平明顯高于其他臨床分型，提示腎型HSP患兒體內(nèi)存在更加嚴(yán)重的T細(xì)胞功能紊亂。

4 結(jié) 論

本研究表明，HSP患兒體內(nèi)存在免疫失衡，表現(xiàn)為Th1/Th2分化失衡，IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4、TNF水平升高，MP感染合并HSP時IL-4水平升高更加明顯。此外，腎型HSP-MP感染患兒年齡和CD8+水平均高于其他臨床分型，CD4+/CD8+低于其他臨床分型，可為臨床對HSP-MP感染患兒盡早進(jìn)行臨床分型提供參考，有利于及早進(jìn)行個體治療，盡早康復(fù)。