王麗文，段國鋒

（山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西太谷030801）

近年來，航天事業(yè)和生物育種技術的飛速發(fā)展引領了太空誘變育種的潮流[1]。太空育種是指利用重力、磁場等特殊的太空環(huán)境誘變作用，使生物或植物基因產(chǎn)生變異，以此創(chuàng)造出罕見的突變材料，對于開展突破性新品種的選育有著至關重要的作用，在很多領域如能源、植物、環(huán)境、生物化工等方面發(fā)揮了巨大的作用，是一種有效的誘變育種新技術[2]。目前，很多研究表明，通過改變超重力處理的時間以及重力加速度等能夠影響植物幼苗的生長發(fā)育。段國鋒等[3]通過超重力處理黑大豆幼苗的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過處理后的幼苗葉綠素含量、過氧化物酶（POD）活性以及超氧化物歧化酶（SOD）活性均高于未經(jīng)處理的黑大豆幼苗。SOGA 等[4-5]通過超重力對玉米和紅豆的研究發(fā)現(xiàn)，超重力對植物幼苗的影響主要是抑制幼苗胚軸的延長。KITTANG 等[6]通過超重力處理8 000 個擬南芥基因，發(fā)現(xiàn)有177 個基因出現(xiàn)了變化。郭小建等[7]研究發(fā)現(xiàn)，通過降低重力加速度以及時間可以增強綠豆幼苗的過氧化氫酶和過氧化物酶活性。這些研究表明，經(jīng)過超重力處理可能會對植物種子的萌發(fā)及其生理生化特性產(chǎn)生影響。

平邑甜茶屬于湖北海棠類，具有較強的抗寒性和抗?jié)承?，耐濕耐鹽，對蘋果根腐病、白粉病、白絹病、褐斑病及蘋果綿蚜具有天然抗性[8]，具有非常強的無融合生殖能力，是優(yōu)異的蘋果種質(zhì)資源。目前，蘋果的再植障礙問題會使蘋果樹出現(xiàn)生長發(fā)育不良的現(xiàn)象，從而造成嚴重的經(jīng)濟損失[9-11]。

為研究蘋果種子的抗逆性，從而提高種質(zhì)，本試驗通過改變超重力和作用時間來研究超重力技術對平邑甜茶種子萌發(fā)以及生理特性的影響，為今后超重力在植物育種以及抗逆栽培方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試平邑甜茶種子由山東農(nóng)業(yè)大學提供。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 取干凈飽滿且經(jīng)過低溫層積的平邑甜茶種子，用98 ℃的熱水燙種3～5 s 對其進行消毒處理，為了避免燙傷種子，在消毒期間要不斷攪拌，之后迅速轉(zhuǎn)入到冷水中，浸泡6 h?？厮栏珊?，采用 5 000、10 000、15 000 r/min 的超重力分別對種子進行1、3、5 h 高速離心處理，以無超重力處理為對照，每組處理設置3 次重復。將處理好的平邑甜茶種子置于內(nèi)鋪雙層濾紙的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，加入適量蒸餾水置于（25 ± 1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培育，每隔24 h 更換蒸餾水和濾紙。

1.2.2 種子發(fā)芽率的測定 每天在同一時間記錄種子的發(fā)芽數(shù)（芽長為種子長度1/2 為準），計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)。

式中，Gt 為t 時間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；Dt 為相應的發(fā)芽天數(shù)。

1.2.3 幼苗形態(tài)指標測定 發(fā)芽結(jié)束后，每處理隨機取幼苗5 株，將樣品按照清水→洗滌劑→清水→1%鹽酸→3 次去離子水的順序進行沖洗并用濾紙吸干，之后迅速稱質(zhì)量記錄并取其平均值作為鮮質(zhì)量，然后測量根長和芽長，隨后在80 ℃下烘干至恒質(zhì)量，取平均值即為干質(zhì)量[12]。

1.2.4 幼苗抗氧化酶活性的測定 待幼苗長出第3片真葉時，移栽到育苗盤中，隨機摘取不同部位的葉片進行生理指標的測定。葉綠素含量的測定采用分光光度法，過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性分別采用愈創(chuàng)木酚法、紫外吸收法和NBT 光還原抑制法進行測定[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SAS 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理與統(tǒng)計，所得數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超重力處理對平邑甜茶種子萌發(fā)的影響

由表1 可知，超重力處理后，平邑甜茶種子的各發(fā)芽指標（發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及發(fā)芽指數(shù)）呈現(xiàn)不同程度的變化。平邑甜茶在中速（10 000 r/min）的超重力下，在3 h 處理時各發(fā)芽指標均大于對照，達到最大值；在低、高速（5 000、15 000 r/min）的超重力處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及發(fā)芽指數(shù)均隨著處理時間的延長而降低。高速超重力處理下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及發(fā)芽指數(shù)均明顯降低，推測可能是由于過度的超重力影響了平邑甜茶種子的發(fā)芽機制，損傷了種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)[14]。在種子萌發(fā)的過程中，培養(yǎng)到第15 天時，種子萌發(fā)相對較多（作為高峰期階段），在10 000 r/min 的超重力處理3 h 下，發(fā)芽勢最大。總體來看，發(fā)芽指標隨著超重力的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

表1 不同超重力處理對平邑甜茶種子發(fā)芽指標的影響

2.2 超重力處理對平邑甜茶幼苗形態(tài)的影響

從表2 可以看出，與對照相比，經(jīng)超重力處理后，平邑甜茶幼苗的株高、根長、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均有不同程度的降低。隨著處理重力加大，幼苗各項指標不斷降低，其中，株高（降幅為0.07%～0.21%）和根長（降幅為0.04%～0.13%）差異明顯；相同重力處理下，隨著超重力處理時間延長，各項指標也在不斷減小。表明，超重力處理對平邑甜茶幼苗的生長有抑制作用。

表2 不同超重力處理對平邑甜茶幼苗形態(tài)的影響

2.3 超重力處理對平邑甜茶幼苗葉綠素含量的影響

作為光能的吸收器，葉綠素含量的高低與植株體內(nèi)有機物的生成量息息相關[15]。葉綠素在植物光合作用過程中充當光能的“吸收者”和“傳遞者”，少數(shù)葉綠素a 可以將光能轉(zhuǎn)化為化學能，釋放氧氣，給植物自身以及人類活動提供所需能量。通常來說，植物中所含葉綠素越多，能夠通過光能進行合成生產(chǎn)的有機物質(zhì)也就越多。由表3 可知，平邑甜茶種子經(jīng)超重力處理后，葉綠素a、葉綠素b 以及葉綠素含量均顯著高于對照。隨著超重力增加，葉綠素含量增加，15 000 r/min 處理5 h 的葉綠素含量最高，與對照間差異均達顯著水平。這與段國鋒等[3]在大白菜中發(fā)現(xiàn)“超重力可以促進葉綠素的合成”的結(jié)論一致。平邑甜茶葉片在低速（5 000 r/min）的超重力處理下，葉綠素a、葉綠素b 以及葉綠素的含量均隨著處理時間的延長而降低，而在中高速（10 000、15 000 r/min）的超重力下，各葉綠素含量均表現(xiàn)出隨著處理時間延長而增加。當超重力轉(zhuǎn)速一定時，差異不顯著，即處理時間對葉綠素含量的影響并不顯著。葉綠素a/b 值是在5 000 r/min 處理3 h 最大。表明，15 000 r/min 處理5 h 有利于平邑甜茶葉綠素含量的提高。

表3 不同超重力處理對平邑甜茶葉片葉綠素含量的影響

2.4 超重力處理對平邑甜茶幼苗抗氧化酶活性的影響

過氧化物酶（POD）既與植物的形態(tài)發(fā)生和建成有關，又與植物的抗逆性有關，是重要的植物保護酶之一[16]。超氧化物歧化酶（SOD）可以清除生物體內(nèi)多余的氧自由基，在機體代謝過程中減緩過多的氧自由基給機體帶來的危害[17]。過氧化氫酶（CAT）作為生物防御系統(tǒng)的一種關鍵酶，可清除由于植物體內(nèi)活性氧代謝增強而導致過度積累的過氧化氫（H2O2），以保護細胞正常生活，其活性可有效抵抗植物衰老[18-19]。影響抗氧化酶活性的因素有很多，伍鈞等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Pb 脅迫下氮素形態(tài)及施氮量對酶活性的影響效果顯著；張冠初等[21]在干旱和鹽脅迫的條件下研究了花生抗氧化酶活性的變化。本試驗則研究了超重力處理對平邑甜茶抗氧化酶活性的影響，結(jié)果如表4 所示。

表4 不同超重力處理對平邑甜茶幼苗抗氧化酶活性的影響

從表4 可以看出，與對照相比，經(jīng)超重力條件處理后POD 活性均明顯提高，其中，10 000 r/min 處理1 h 后的POD 活性最高。處理相同時間時，POD活性隨著超重力的增大呈先增加后降低，超重力轉(zhuǎn)速一定時差異不顯著。處理組的SOD 活性顯著低于對照，10 000 r/min 處理 5 h 的 SOD 活性最低。在低速（5 000 r/min）的超重力處理下，SOD 的活性隨著處理時間的延長而增高，而在中高速（10 000、15 000 r/min）的超重力下，SOD 活性均隨著處理時間的延長而降低。在一定的處理時間下，SOD 活性隨著重力的增大呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。處理組的CAT 活性與對照相比，有增強也有降低，10 000 r/min處理3 h 的CAT活性增強最明顯，而在15 000 r/min條件下處理5 h 后活性最低。以上結(jié)果說明，只有在適當?shù)某亓l件下處理適當時間才可以提高POD、CAT 活性，而SOD 活性經(jīng)超重力處理后反而有失活的現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

本試驗測定了平邑甜茶種子在經(jīng)過不同超重力處理后的萌芽情況，結(jié)果表明，平邑甜茶種子經(jīng)超重力處理后，發(fā)芽率、發(fā)芽勢以及發(fā)芽指數(shù)隨著超重力的增加呈現(xiàn)先增加后降降的趨勢，在10 000 r/min處理3 h 時各發(fā)芽指標值最大。平邑甜茶種子在未經(jīng)超重力處理時，其萌發(fā)率極低，并且在超重力處理后，與對照組無顯著差異，與段智英等[22]在番茄中研究發(fā)現(xiàn)的“超重力使其發(fā)芽指標降低”的結(jié)論不符合，猜測可能是由于平邑甜茶種子本身萌發(fā)率低，因此，抑制作用不明顯，再加上試驗樣本較少，偶然性較大。

經(jīng)過對幼苗形態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，隨著超重力的加大（處理時間相同），平邑甜茶幼苗的株高、根長、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量與對照相比均出現(xiàn)了不同程度的降低，其中，株高和根長降幅差異明顯，在相同超重力條件下，隨著處理時間的增加，各項指標也在不斷減小。研究結(jié)果表明，超重力處理對平邑甜茶幼苗的生長有明顯抑制作用。

萌發(fā)的平邑甜茶幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素含量經(jīng)過超重力處理后均顯著高于對照。隨著超重力增強，平邑甜茶幼苗的葉綠素含量也隨之增加，在15 000 r/min 的超重力處理5 h 時，葉綠素各含量達到最大，與對照組相比，每克葉片中的葉綠素含量增加了2.815 mg。因此，只有在適當超重力處理條件（15 000 r/min、5 h）才能對平邑甜茶幼苗的葉綠素合成有利，能夠促進有機物的生成，并且能夠進一步提高平邑甜茶的抗逆栽培能力。

平邑甜茶葉片的POD、CAT 活性都高于對照，與前人的研究結(jié)果相同，在10 000 r/min 超重力下處理 1 h 時，POD 活性達到最大值，10 000 r/min 處理3 h 的CAT 活性增強最明顯，說明適當?shù)某亓μ幚砜梢愿玫靥岣咧参镌谀婢持械纳婺芰?，并對植物光合速率和呼吸速率有一定的影響。SOD 活性均低于對照，在低速超重力處理下，隨著處理時間的延長而增高，而在中高速超重力下，隨著處理時間的延長而降低，在一定的處理時間下，SOD 活性隨著超重力的增大呈先降低后增加。而楊凈等[23]在研究超重力處理對谷子種子影響的過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超重力處理的2 種谷子的SOD 活性均高于對照組，并且差異顯著，此結(jié)論與本試驗不相符，有可能是因為該超重力范圍不適合SOD 生存，可以嘗試改變超重力設置的梯度，從而提高SOD 活性。

本研究結(jié)果表明，超重力技術能夠影響平邑甜茶種子發(fā)芽指標、葉綠素含量、幼苗形態(tài)以及生理特性，因此，通過離心處理來模擬超重力這種極端的環(huán)境是可行的，有希望為植物育種以及抗逆方面的探索提供一定的理論支持。