韓月丹 毛培江 業(yè) 康 金 捷 黃晶晶 欒會(huì)玲 金祖漢 王志安

1 杭州市第一人民醫(yī)院 浙江 杭州 310006

2 浙江省中藥研究所有限公司 浙江 杭州 310023

本研究以有毒藥材姜半夏為例，小鼠AML12肝細(xì)胞為研究載體，比較同批次藥材來(lái)源的姜半夏配方顆粒與其傳統(tǒng)飲片煎劑相同生藥濃度下的毒性差異，為配方顆粒有效性、安全性、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等研究提供實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)，為配方顆粒的臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品：姜半夏配方顆粒（批號(hào)：K1704059）：稱取姜半夏配方顆粒2g（每克配方顆粒相當(dāng)于12g生藥），研缽內(nèi)加蒸餾水研磨成細(xì)粉后，加純水稀釋定容至100ml，得濃度為0.24g生藥/ml藥液（240g生藥/L），臨用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋成濃度為48g生藥/L的母液。姜半夏飲片煎劑（批號(hào)：17042106)：稱取240g中藥飲片放于煎藥罐中，煎煮兩次，合并濾液，55℃恒溫烘干后粉碎，得69.8g干粉，相當(dāng)于3.44g生藥/g干粉。稱取6.98g干粉，純水稀釋定容至100ml，得濃度為0.24g生藥/ml藥液（240g生藥/L），臨用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋成濃度為48g生藥/L的母液。樣品均由浙江景岳堂藥業(yè)有限公司提供。

1.2 試劑 ：DMEM/F12（1∶1)培 養(yǎng)液（GIBCO，批號(hào)8118043）；胎牛血清（四季青，批號(hào)20170315）；胰蛋白酶-EDTA（GENVIEW，批號(hào) 711160101100）；雙抗（GEN‐VIEW，批號(hào)84020101100）；四甲基偶氮唑藍(lán)（Amresco）；二甲基亞砜（Amresco，批號(hào)1077C109）；Hoechst33258熒光染液（碧云天，批號(hào)032318180417）；抗熒光猝滅封片液（碧云天，批號(hào)030218180319）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：精密天平（BS110S，北京賽多利斯天平公司）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（M200，TECAN）；二氧化碳孵育溫箱（NU 5810E，NUAIRE）；超凈臺(tái)（SW-CJ-IF，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；熒光顯微鏡（DM 4000，Leica）；光學(xué)顯微鏡（XSZ-D2，重慶光學(xué)儀器廠）。

1.4 細(xì)胞：小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞株AML12，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：AML12肝細(xì)胞用含10% FBS，1%青-鏈霉素的DMEM/F12（1∶1)完全培養(yǎng)液（含1ml ITS Liquid Media Supplement/100ml、40ng地塞米松/100ml）培養(yǎng)，置37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，飽和濕度下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。觀察其培養(yǎng)液的顏色變化與細(xì)胞生長(zhǎng)情況，及時(shí)換液，細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：每塊96孔板設(shè)6個(gè)空白孔，給藥組分別加入不同濃度（母液組以及1/2、1/4、1/20、1/100、1/500、1/2500、1/12500母液濃度組）的姜半夏配方顆粒與飲片煎劑藥液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔200μl，暴露48h后，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處各孔A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（A給藥組-A空白）/（A對(duì)照組-A空白）×100%。

2.3 Hoechst33258染色法檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)：以每毫升5×104個(gè)細(xì)胞接種至六孔板，每孔2ml，分別加入1/20和1/100母液濃度（母液濃度為48g生藥/L）的姜半夏中藥配方顆粒與其飲片煎劑，設(shè)不加藥物的對(duì)照組，暴露48h后，每孔加入0.5ml 4%多聚甲醛固定后棄去固定液，每孔加入0.5ml Hoechst33258染液，染色5min，滴一滴抗熒光猝滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，在激發(fā)波長(zhǎng)360nm處用顯微鏡觀察并拍照，進(jìn)行細(xì)胞核形態(tài)觀察，并使用Image J軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度半定量分析。

3 結(jié)果

3.1 姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑對(duì)AML12肝細(xì)胞活力的影響：姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑作用AML12肝細(xì)胞48h后，配方顆粒母液組以及1/2、1/4、1/20、1/100、1/500、1/2500、1/12500母液濃度組的細(xì)胞存活率分別為（140.47±10.45）%、（130.58±13.34）%、（119.72± 12.36）%、（104.71± 6.55）%、（104.43±5.75）% 、（101.60 ± 6.65）% 、（103.21 ± 9.93）% 、（100.32±6.38）%；飲片煎劑母液組以及1/2、1/4、1/20、1/100、1/500、1/2500、1/12500母液濃度組細(xì)胞存 活 率 為（145.23± 14.86）%、（126.79±4.87）%、（112.88±3.97）%、（91.79±3.09）%、（91.09±6.74）%、（94.95±5.25）%、（94.62±4.93）%、（93.28±4.11）%（結(jié)果見(jiàn)圖1）。結(jié)果表明，暴露48h后，姜半夏配方顆粒（1/20-1）濃度組和姜半夏飲片煎劑（1/20-1）濃度組隨著濃度的增加，增強(qiáng)了細(xì)胞的活力，但濃度為1/20與1/100時(shí)兩組間具有極顯著性差異，其中飲片煎劑組出現(xiàn)了細(xì)胞抑制的情況。

圖1 48h不同濃度姜半夏配方顆粒與飲片煎劑對(duì)AML12細(xì)胞存活率的影響（n=6)

3.2 姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑對(duì)AML12肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響：根據(jù)MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇1/20和1/100母液濃度（母液濃度為48g生藥/L）的姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑進(jìn)行熒光染色對(duì)比實(shí)驗(yàn)。姜半夏配方顆粒組與其飲片煎劑組作用于AML12肝細(xì)胞48h后，均出現(xiàn)不同程度細(xì)胞核固縮、胞質(zhì)濃縮、部分破裂等凋亡現(xiàn)象，其熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；相同劑量下比較，姜半夏配方顆粒組細(xì)胞核固縮凋亡情況較飲片煎劑組少（結(jié)果見(jiàn)圖2）。熒光半定量結(jié)果同樣顯示在藥品母液濃度的1/20與1/100時(shí)，姜半夏配方顆粒組細(xì)胞凋亡的較其飲片煎劑組少（結(jié)果見(jiàn)圖3）。結(jié)果表明，姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑組均對(duì)AML12肝細(xì)胞有一定的損傷；在相同濃度下，姜半夏配方顆粒對(duì)細(xì)胞的損傷較其飲片煎劑小。

4 討論

圖2 熒光顯微鏡觀察姜半夏配方顆粒與飲片煎劑處理AML12細(xì)胞48 h后Hoechst33258染色細(xì)胞核形態(tài)（標(biāo)尺：100μm）

圖3 熒光強(qiáng)度半定量分析結(jié)果

目前，中藥配方顆粒在美國(guó)、日本等國(guó)家發(fā)展極快，除滿足本國(guó)外還大量出口。我國(guó)對(duì)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)也開(kāi)始重視和大力推動(dòng)，把中藥配方顆粒納入國(guó)家中醫(yī)藥方面發(fā)展的重要內(nèi)容之一。對(duì)于中藥配方顆粒與其飲片煎劑特別是有些毒性藥材、復(fù)方等的有效性、安全性是否一致，學(xué)術(shù)界尚一直存有爭(zhēng)論。

本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平，對(duì)有毒中藥姜半夏配方顆粒與其傳統(tǒng)煎劑的毒性進(jìn)行了初步的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，生姜與生半夏同用可以顯著減少生半夏對(duì)小鼠腹腔的刺激性。而在藥物細(xì)胞毒性的早期研究過(guò)程中，通過(guò)體外肝細(xì)胞作為通用的肝毒性體外試驗(yàn)工具，常對(duì)藥物的早期安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物濃度為母液濃度1/20與1/100時(shí)，兩組間具有極顯著性差異，其中姜半夏飲片煎劑組出現(xiàn)了細(xì)胞抑制情況。熒光實(shí)驗(yàn)中，AML12肝細(xì)胞在姜半夏配方顆粒與其飲片煎劑作用48h后，與對(duì)照組比較均出現(xiàn)不同程度細(xì)胞核固縮，其熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。熒光半定量結(jié)果顯示在相同劑量下，姜半夏飲片煎劑使熒光更強(qiáng)，證明其細(xì)胞核固縮更顯著，細(xì)胞凋亡更明顯，因此說(shuō)明姜半夏配方顆粒對(duì)小鼠AML12肝細(xì)胞毒性小于姜半夏飲片煎劑。具體原因有待后續(xù)結(jié)合成分分析等更深入的研究來(lái)驗(yàn)證。

本研究探索性地使用細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的方法對(duì)比姜半夏飲片煎劑與其所制成中藥配方顆粒的毒性差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同生藥濃度下，中藥配方顆粒毒性小于其飲片煎劑。