陳如兵 樓柯浪 吳曉俊 張春椿
1 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007
2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053
前胡是傘形科前胡屬多年生草本植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根,其味苦、辛,微寒,具有降氣化痰,散風(fēng)清熱。隨著臨床藥用逐漸加大,野生資源瀕臨枯竭。本研究旨在探究種源與肥料對(duì)前胡的影響,為探究更適合前胡的種植方式提供理論依據(jù)。
1.1 儀器:Alliance e2695高效液相色譜儀(waters公司);PDA FLR檢測(cè)器(waters公司);KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AR224CN型電子分析天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]。
1.2 試劑:白花前胡甲素、白花前胡乙素(純度均≥98.50%,購(gòu)于曼思特生物科技公司);甲醇(色譜純);三氯甲烷、二乙胺等均為分析純,水為去離子。
2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì):大田試驗(yàn)于2018~2019年間進(jìn)行,試驗(yàn)田位于浙江省杭州市淳安縣臨岐鎮(zhèn)。試驗(yàn)田按兩部分內(nèi)容同時(shí)展開。第一部分:一年生抽薹前胡種子、兩年生抽薹前胡種子、野生前胡種子以及使用前胡殘留根;第二部分:CK(不施肥)、施復(fù)合肥、施有機(jī)肥。播種時(shí)間為2018年三月春播,播種方式為條播,播種時(shí)間為一年,采收時(shí)測(cè)定小區(qū)產(chǎn)量,轉(zhuǎn)換成每公頃產(chǎn)量。
2.2 白花前胡甲素和白花前胡乙素的測(cè)定:分述如下。
2.2.1 色譜條件:C18色譜柱,柱溫為25℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為321nm,流動(dòng)相為A(甲醇)及B(水)兩相等度(75:25)洗脫,流速為1.0ml/min,采用PDA FLR檢測(cè)器。理論板數(shù)按白花前胡甲素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[1]。
2.2.2 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取白花前胡甲素6mg,置于10ml棕色容量瓶中,加甲醇制成0.6mg/ml白花前胡甲素對(duì)照品的溶液;同上方法制備得到0.6mg/ml的白花前胡乙素對(duì)照品溶液,并都存于4℃冰箱備用。
2.2.3 線性關(guān)系考察:取標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml,5ml,10ml,15ml,20ml分別置于20ml容量瓶中,加甲醇定容搖勻,按“2.2.1”色譜條件項(xiàng)下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別得到白花前胡甲素和白花前胡乙素的回歸方程:白花前胡甲素Y=22381X-233494,R2=0.9999,線性范圍 36~720μg/ml和白花前胡乙素Y=17048X-171386,R2=0.9999,線性范圍36~720μg/ml。
2.2.4 精密度考察:精密取對(duì)照品溶液,按“2.2.1”色譜條件項(xiàng)測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果白花前胡甲素和白花前胡乙素的RSD分別為為0.16%和1.28%,表明儀器的精密度良好。
2.2.5 穩(wěn)定性考察:取同一供試品溶液,分別在0,2,4,8,12,24h時(shí)按“2.2.1”色譜條件項(xiàng)測(cè)定,結(jié)果白花前胡甲素和白花前胡乙素的RSD分別為為0.52%和0.91%,表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.6 重復(fù)性考察:精密稱取前胡樣品6份,按“2.2.1”色譜條件項(xiàng)測(cè)定,結(jié)果白花前胡甲素和白花前胡乙素的RSD分別為為0.27%和1.41%,表明該方法重復(fù)性好。
2.2.7 加樣回收考察:精密稱取前胡樣品6份,分別加入不同含量的白花前胡甲素和白花前胡乙素對(duì)照品,制得3份不同濃度的樣品,并且每個(gè)平行3份,按“2.2.1”色譜條件項(xiàng)測(cè)定,結(jié)果白花前胡甲素和白花前胡乙素RSD分別為0.73%和1.46%,表明方法準(zhǔn)確度好。
2.2.8 樣品含量測(cè)定:取干燥的前胡樣品細(xì)粉約0.50g,精密稱定,置100ml具塞錐形瓶中,精密加入三氯甲烷25ml,塞密,稱定重量,超聲處理10min,放冷,再稱定重量,用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò);精密量取續(xù)濾液5ml,蒸干,殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。進(jìn)樣前用0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾,得供試品溶液。取供試品溶液10μl進(jìn)樣,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中白花前胡甲素和白花前胡乙素的量。
2.3 數(shù)據(jù)處理:采用Excel2019、SPSS 25.0和Graph‐pad prism 8軟件分析作圖。
3.1 不同種源與不同肥料對(duì)前胡產(chǎn)量的影響:由圖1可以看出,野生組的產(chǎn)量明顯低于其他組別,其次是兩年生組,而一年生和殘留根無(wú)顯著性差異,可見(jiàn)還是正常一年生的前胡種子產(chǎn)量相對(duì)較大;不施肥的CK組產(chǎn)量明顯低于施肥組,復(fù)合肥產(chǎn)量稍低于有機(jī)肥組,可見(jiàn)施肥有助于提高前胡的產(chǎn)量,有機(jī)肥的產(chǎn)量提高相對(duì)較高。
圖1 不同種源與不同肥料對(duì)前胡產(chǎn)量的影響
3.2 不同種源與不同肥料對(duì)前胡有效成分含量的影響:結(jié)果見(jiàn)圖2。種子年限對(duì)白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量存在著一定的影響,年限增大兩者含量有相應(yīng)的降低,其中對(duì)白花前胡乙素的影響較大。野生組白花前胡甲素的含量大于一年生組,同為一年生種子來(lái)源的殘留根組白花前胡甲素含量與一年生組無(wú)顯著性差異,CK組的白花前胡甲素含量遠(yuǎn)高于施肥的兩組。殘留根組與兩年生組的白花前胡乙含量明顯低于低于其他組別??梢?jiàn)仿野生栽培能相對(duì)有效的增加前胡有效成分的含量,兩年生的種子與殘留根栽培的方式無(wú)利于前胡有效成分的積累,施肥也會(huì)一定程度降低前胡有效成分的積累。
有效成分是評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的中藥指標(biāo)之一[2],產(chǎn)量是影響中藥材經(jīng)濟(jì)效益的重要因素,因此本文通過(guò)測(cè)量前胡的有效成分與產(chǎn)量探究不同種源以及不同肥料對(duì)前胡的影響,從而尋求一種相對(duì)合適的前胡種植方式。不同的種源以及不同肥料,都會(huì)對(duì)中藥材有效成分的合成產(chǎn)生一定的影響,導(dǎo)致中藥材質(zhì)量產(chǎn)生差異。[3-6]本研究結(jié)果顯示,不同的種源對(duì)白花前胡乙素的影響較大,對(duì)有效成分總含量表現(xiàn)為野生>一年生>殘留根>兩年生,其中一年生組與殘留根組無(wú)顯著性差異,野生組有效成分含量雖高但產(chǎn)量偏低,整體表現(xiàn)常規(guī)一年生種子仍然存在一定優(yōu)勢(shì),筆者推測(cè)前胡種子年限增加不利于有效成分積累以及產(chǎn)量的提高。本文還考察了不同肥料對(duì)前胡藥材的影響,結(jié)果還表明了,施不施肥對(duì)白花前胡乙素的含量無(wú)顯著性差異,不施肥情況下白花前胡甲素的含量卻又顯著性增高,但不施肥情況下產(chǎn)量卻不盡人意。筆者推測(cè)肥料的施加可能會(huì)影響白花前胡甲素的積累。綜上所述,針對(duì)野生種子組以及不施肥組的有效成分總含量都相對(duì)較高的情況,筆者推測(cè)仿野生栽培模式可能更有利于前胡藥材的質(zhì)量的提升,對(duì)于仿野生栽培的研究需要更深一步的探討。
圖2 不同種源與不同肥料對(duì)前胡有效成分含量的影響