王玉柱，劉文舒，李思明，黎德兵，郭小澤

( 1.江西省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200； 2.四川農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，四川 成都 611130 )

黑斑蛙(Pelophylaxnigromaculatus)，屬蛙科，側(cè)褶蛙屬，又稱黑斑側(cè)褶蛙，廣泛分布于東亞、東北亞地區(qū)，是中國大陸分布最廣的兩棲動物之一[1]。黑斑蛙主要棲息在稻田、池塘、水渠、小河等地[2]，可食用和藥用[3]，具有重要生態(tài)和經(jīng)濟價值。

黑斑蛙等變溫動物主要依靠環(huán)境中的熱源調(diào)節(jié)體溫和機體代謝[4]，水溫是其胚胎發(fā)育的重要影響因子之一。當水溫過高時，水中溶解氧含量降低[5]，機體能量消耗速度加快[6]，機體各類亞細胞結(jié)構(gòu)的功能和交互作用減弱[7]，導致胚胎死亡率增加，生長發(fā)育增速[8]；而遭受低溫影響時，蛙類胚胎發(fā)育會減緩，體質(zhì)量降低[9]。近年來，溫度對兩棲類胚胎生長發(fā)育影響的研究逐漸增多，在飾紋姬蛙(Microhylafissipes)[10]、東北林蛙(Ranadybowskii)[11]、大蟾蜍(Bufogargarizans)[12]、棘胸蛙(R.spinosa)[13]等兩棲類動物上已有報道，但是關(guān)于水溫對黑斑蛙胚胎發(fā)育的研究鮮有報道。筆者通過設(shè)置不同水溫來研究黑斑蛙胚胎發(fā)育的變化，以期對黑斑蛙胚胎發(fā)育提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑斑蛙卵來源于江西省九江市都昌縣漁童黑斑蛙養(yǎng)殖基地，試驗地點為江西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所。試驗用水為經(jīng)過充分曝氣的地下水，pH 7.2，溶解氧>5 mg/L。孵化缸為50 cm×30 cm×44 cm玻璃缸，每日注換1/3體積等溫水，孵化缸內(nèi)放置可定溫加熱器和數(shù)顯溫度計。

1.2 試驗方法

設(shè)定18、21、24、27、30、33 ℃ 6個水溫梯度，每個梯度3個平行；共設(shè)置18個孵化缸，并對18個孵化缸進行標號。選取蛙卵發(fā)育階段為15期(根據(jù)文獻[14]對黑斑蛙發(fā)育階段分類標準判定)的卵塊數(shù)團，分成含100粒卵的小卵塊18團，隨機放入18個孵化缸內(nèi)，用木框棉網(wǎng)托舉在水面上，保持卵塊浸沒在水面以下約1 cm，光周期為12L∶12D。卵塊放置完畢后進行計時，每隔12 h記錄胚胎的發(fā)育階段；在各試驗組19期(19期為心跳期，大多數(shù)蝌蚪在此時脫出卵黃膜，在咽區(qū)腹側(cè)部可見微弱心跳)時統(tǒng)計孵化率，25期(25期時鰓蓋已發(fā)育完成，可以開始攝取食物)時統(tǒng)計各組成活率、發(fā)育指標(體長、體質(zhì)量、體寬、尾長)。發(fā)育指標測定標準如下：

體長：吻端到尾末端處長度；

體寬：體兩側(cè)最寬處長度；

尾長：肛門到尾末端處長度。

孵化率和25期成活率計算公式如下：

孵化率/%=n1/n0×100%

25期成活率/%=n2/n1×100%

式中，n0為投放黑斑蛙卵數(shù)量，n1為19期出膜蝌蚪數(shù)量，n2為25期存活蝌蚪數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本次試驗數(shù)據(jù)用Excel和SPSS 24.0處理，P<0.05為差異顯著。所有描述性統(tǒng)計值使用平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水溫對黑斑蛙胚胎孵化率和25期成活率的影響

根據(jù)文獻[14]對黑斑蛙生長階段的劃分，大多數(shù)的黑斑蛙胚胎在19期時孵化成蝌蚪，在此階段可以觀察到胚胎外包裹的卵黃膜破裂，腹側(cè)部可以看見微弱的心臟波動。由表1可知，18 ℃水溫條件下，黑斑蛙胚胎孵化率為96.41%，略低于其他溫度梯度，但是各溫度梯度之間孵化率并無顯著差異(P>0.05)。黑斑蛙胚胎脫離卵黃膜的保護后，更易受到環(huán)境因素的影響，在胚胎發(fā)育至25期時，成活率出現(xiàn)了較為明顯的差異。21、24、27 ℃水溫條件下25期成活率顯著高于18、30、33 ℃(P<0.05)，27 ℃水溫條件下25期成活率(84.63%)比33 ℃(42.53%)高出98.99%，成活率態(tài)勢依次為27 ℃>24 ℃>21 ℃>30 ℃>18 ℃>33 ℃。

2.2 不同水溫對黑斑蛙發(fā)育指標的影響

黑斑蛙蝌蚪發(fā)育至25期時，各器官基本發(fā)育完全，正式開始攝取食物。在25期測量各組胚胎的體質(zhì)量、體長、尾長和體寬(表2)，18、21、24、27、30 ℃水溫下黑斑蛙蝌蚪體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)，21、24、27、30、33 ℃水溫條件下黑斑蛙蝌蚪體質(zhì)量差異也不顯著(P>0.05)，但黑斑蛙蝌蚪體質(zhì)量呈現(xiàn)隨著溫度的升高而逐漸上升的趨勢，33 ℃體質(zhì)量(10.30 mg)比18 ℃(6.65 mg)高出54.89%。體長、尾長隨著水溫的升高表現(xiàn)出先升后降的趨勢，18 ℃水溫下體長和尾長最小，分別為(7.97±0.49) mm和(4.85±0.32) mm，30 ℃水溫下體長和尾長最大，分別為(8.90±0.36) mm和(5.48±0.39) mm；30 ℃比18 ℃體長和尾長高出11.67%和12.99%。24、27、30、33 ℃水溫下黑斑蛙蝌蚪體長和尾長明顯大于18、21 ℃。體長態(tài)勢依次為30 ℃>27 ℃>33 ℃>24 ℃>21 ℃>18 ℃。尾長態(tài)勢依次為30 ℃>24 ℃>27 ℃>33 ℃>21 ℃>18 ℃。黑斑蛙蝌蚪的體寬在不同水溫中也表現(xiàn)出先增后減的趨勢，30 ℃水溫下黑斑蛙蝌蚪體寬最大，為(2.13±0.17) mm，18 ℃水溫下體寬最小，為(1.94±0.14) mm。30 ℃比18 ℃體寬高出9.79%，體寬態(tài)勢為30 ℃>27 ℃>24 ℃>33 ℃>21 ℃>18 ℃。

表1 不同水溫條件下黑斑蛙胚胎孵化率和25期成活率Tab.1 Survival rate of phase 25 and hatching rate of frogP. nigromaculatus embryos at different water temperatures

2.3 不同水溫對黑斑蛙胚胎發(fā)育歷期的影響

在不同水溫條件下，黑斑蛙胚胎的發(fā)育速度表現(xiàn)出明顯差異。當環(huán)境水溫降低時，黑斑蛙胚胎的發(fā)育歷期有大幅延長，18 ℃水溫下黑斑蛙胚胎從15期發(fā)育至19期孵化用時(48 h)比33 ℃水溫下用時(10 h)高出380%(圖1)；孵化時長(y)和水溫(x)的關(guān)系式為：y=1.1786x2-15.85x+62.6，r2=0.9931(圖2)。在黑斑蛙胚胎生長至25期時，33 ℃水溫下發(fā)育歷期最短，為60 h(圖1)；18 ℃水溫下胚胎發(fā)育歷期最長，為204 h，比33 ℃高出240%；發(fā)育時長(y)和水溫(x)的關(guān)系式為：y=4.2857x2-57.429x+252，r2=0.9883(圖3)。

表2 不同水溫條件下黑斑蛙發(fā)育指標Tab.2 Developmental indicators of frog P. nigromaculatus at different water temperatures

圖1 不同水溫條件下黑斑蛙胚胎發(fā)育歷期Fig.1 Embryonic development of P. nigromaculatus at different water temperatures

圖2 不同水溫下胚胎發(fā)育至19期時所用時間Fig.2 The time taken for embryo development to phase 19 at different water temperatures

圖3 不同水溫下胚胎發(fā)育至25期時所用時間Fig.3 The time taken for embryo development to phase 25 at different water temperatures

3 討 論

3.1 蛙類胚胎發(fā)育對水溫的要求和適應(yīng)性

蛙型目生物在我國有240多種，分布地區(qū)廣泛。由于蛙的種類和分布地區(qū)的不同，蛙類胚胎發(fā)育對水溫的要求和適應(yīng)性有很大差異。中國林蛙(R.chensinensis)在10～14 ℃水溫中胚胎孵化率可以達到97%以上，并且在8～20 ℃水溫中均可正常發(fā)育[15]；棘胸蛙在20～23 ℃時，孵化率超過80%，但水溫超過26 ℃時，胚胎就出現(xiàn)了畸形發(fā)育[13]；虎紋蛙(R.tigrinarugulosa)的最適胚胎發(fā)育水溫約25 ℃[16]；飾紋姬蛙在28 ℃水溫下具有最佳的生長表現(xiàn)[10]；本試驗中，黑斑蛙在24～27 ℃水溫下得到了最高的孵化率、最低的死亡率和最優(yōu)的生長指標。綜上可知，不同蛙類胚胎發(fā)育對外界水溫的變化均十分敏感，而不同蛙類對水溫的要求和適應(yīng)性有較大區(qū)別。另外，不同地理種群的同種蛙類胚胎發(fā)育對溫度的要求和適應(yīng)性可能會有所差異。分布于海南省和廣東省的虎紋蛙分別在32 ℃和25 ℃孵化率最高[17-18]；北京和沈陽地區(qū)的黑斑蛙胚胎在20 ℃水溫下由15期發(fā)育至25期分別耗時160.4 h和204.69 h[19-20]，本試驗表明，南昌地區(qū)黑斑蛙胚胎在18 ℃水溫下由15期發(fā)育至25期需要204 h，在21 ℃水溫下需要144 h。然而，蛙類胚胎發(fā)育對溫度的可塑性和適應(yīng)性很強，不同地區(qū)蛙類之間對溫度的需求和適應(yīng)性差異可能僅僅是因為胚胎發(fā)育過程中當?shù)丨h(huán)境不同所致，具體原因還需要進一步研究。

3.2 不同水溫對黑斑蛙胚胎孵化率和成活率的影響

與常見蛙類相比，黑斑蛙胚胎具有較強的孵化溫度適應(yīng)性。本試驗中，各組黑斑蛙的孵化率無顯著差異，均在96.41%以上。與其他蛙類相比，環(huán)境水溫由22 ℃升至34 ℃時，牛蛙(R.catesbeiana)孵化率由63%降至29%[21]；環(huán)境水溫由25 ℃升至30 ℃，虎紋蛙孵化率由94.5%降至84.2%[16]；環(huán)境水溫由20 ℃升至32 ℃，中華蟾蜍(Bufogargarizans)胚胎的16期死亡率由1.7%升至100%[22]。黑斑蛙胚胎孵化對水溫的適應(yīng)性明顯強于上述蛙類。孵化溫度適應(yīng)性是胚胎發(fā)育的適應(yīng)性和可塑性的表現(xiàn)之一，也是黑斑蛙分布緯度范圍廣泛的原因之一。

水溫對黑斑蛙胚胎成活率具有顯著影響。本試驗結(jié)果表明，在21～27 ℃水溫中的黑斑蛙胚胎成活率顯著高于其他水溫，24～27 ℃成活率在82.42%以上。本試驗結(jié)果與棘胸蛙[13]、虎紋蛙[17]等蛙類相似，最大成活率溫度區(qū)間均在20 ℃以上，較中國林蛙[23](10～20 ℃)和中華蟾蜍[24](20 ℃以下)等蛙類高；上述蛙類的最大成活率溫度區(qū)間均在6 ℃以上，較寬的溫度區(qū)間是蛙類積極適應(yīng)環(huán)境的表現(xiàn)之一。極端溫度會造成蛙類機體各類亞細胞結(jié)構(gòu)的功能和交互作用減弱，導致成活率降低[7]。蛙類胚胎神經(jīng)快速發(fā)育時期對溫度非常敏感[22]，當溫度過高或過低時，可能會導致胚胎各胚層發(fā)育速度不協(xié)調(diào)，造成神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂而引起死亡；另外，當溫度高于最適胚胎發(fā)育溫度區(qū)間時，胚胎卵黃中營養(yǎng)的供給速度可能不能滿足新陳代謝，導致能量供給紊亂，引起胚胎死亡[21]。

3.3 不同水溫對黑斑蛙胚胎發(fā)育歷期的影響

黑斑蛙胚胎發(fā)育的15期為纖毛動作期，中腰部左右神經(jīng)褶靠近，體表面出現(xiàn)纖毛流，外形特征明顯；王應(yīng)天[25]對黑斑蛙早期胚胎發(fā)育的研究結(jié)果表明，黑斑蛙胚胎由15期發(fā)育至25期歷期約占黑斑蛙胚胎發(fā)育總歷期的4/5。本試驗選用的黑斑蛙卵為自然狀態(tài)下產(chǎn)卵，從基地轉(zhuǎn)移到實驗室的過程中進行了部分發(fā)育，所以選取外形特征十分明顯的15期胚胎進行試驗，以保證所有試驗材料發(fā)育起點相同。

黑斑蛙胚胎發(fā)育歷期在不同水溫環(huán)境中呈現(xiàn)明顯變化，隨著水溫的升高，胚胎發(fā)育歷期顯著縮短，當水溫由18 ℃升至33 ℃時，胚胎15～19期耗時延長了380%。牛蛙[21]在22 ℃水溫下15～19期耗時比34 ℃延長214.29%，虎紋蛙[16]20 ℃比30 ℃延長249.59%，東北林蛙[11]3個不同地理種群12 ℃比24 ℃分別延長了108.84%、104%、105.36%。本試驗結(jié)果與上述結(jié)果基本一致，在一定范圍內(nèi)高溫能夠促進蛙類胚胎和蝌蚪發(fā)育速度，加快胚胎孵化過程。這可能與胚胎發(fā)育的適應(yīng)性與可塑性有關(guān)[26]。

胚胎發(fā)育的適應(yīng)性和可塑性在自然界中廣泛存在，在兩棲類和魚類中有著明顯的表現(xiàn)。胚胎經(jīng)歷了細胞分裂、囊胚發(fā)育、神經(jīng)褶皺的形成、器官的發(fā)育和生長等過程，其適應(yīng)性和可塑性具體表現(xiàn)在各個發(fā)育階段，耗氧量、能量利用效率、卵黃轉(zhuǎn)化效率、心率等可以隨著溫度的變化而改變。當水溫升高時，澳洲莫斯蛙(Bryobatrachusnimbus)[27]胚胎單位時間內(nèi)能量消耗持續(xù)升高，發(fā)育速度加快，耐熱能力增強，另外當水溫升高時，盡管胚胎耗氧量更高，總能量的消耗卻會減少[28]；鯡型白鮭(Coregonusclupeaformis)[29]相關(guān)研究同樣表明，高溫能提高胚胎的心率和耗氧量。澳洲肺魚(Neoceratodusforsteri)[30]隨著水溫升高，孵化后卵黃質(zhì)量也隨之升高，增加了胚胎孵化后的可利用內(nèi)源能量。上述研究結(jié)果均伴隨著胚胎發(fā)育階段的適應(yīng)性和可塑性變化，或者說上述變化均為胚胎發(fā)育適應(yīng)性和可塑性的組成部分和具體體現(xiàn)。

胚胎發(fā)育的適應(yīng)性和可塑性會直接受到環(huán)境因素或者調(diào)整應(yīng)對環(huán)境因素能力的影響[31]，卵黃膜在應(yīng)對這些影響時發(fā)揮了重要作用。卵黃膜在胚胎發(fā)育過程中既提供了保護胚胎免受傷害、減少水分流失、保存胚胎所需營養(yǎng)物質(zhì)的“效益”，又產(chǎn)生了阻礙氧氣吸收和外部食物獲取、限制大小和空間位置的“成本”。當外界環(huán)境溫度偏離正常孵化溫度，改變卵黃膜內(nèi)外的“成本/效益”比時，胚胎就會提前或者推遲孵化。

3.4 不同水溫對黑斑蛙發(fā)育指標的影響

黑斑蛙胚胎表現(xiàn)出了較強的溫度適應(yīng)性，但是本試驗中高溫組(33 ℃)和低溫組(18 ℃)經(jīng)過60 h和204 h的發(fā)育，在25期胚胎發(fā)育完成時發(fā)育指標產(chǎn)生明顯的差異，表現(xiàn)為單體體質(zhì)量相差54.89%，體長相差8.78%，尾長相差8.87%，體寬相差3.61%，胚胎死亡率相差19.08%。王守紅等[10,22]的研究也同樣表明，當蛙類胚胎發(fā)育水溫偏離適宜溫度時，蛙的全長、體寬等發(fā)育指標都會受到顯著影響。蛙類體溫與環(huán)境水溫密切相關(guān)，當環(huán)境水溫超過蛙類等溫區(qū)間時，蛙類體溫隨著環(huán)境水溫的升高而升高，但是會低于環(huán)境水溫。過高的體溫會造成變溫動物心率和耗氧量的增加，加快代謝率，提高生長速度[32-33]；過低的體溫又會造成胚胎發(fā)育時間的延長，過多的營養(yǎng)物質(zhì)用來維持生命活動。這種代謝速率的過快或者過慢不是沒有代價的，在極端水溫下蛙類胚胎發(fā)育指標會偏離正常值，造成蛙胚胎發(fā)育畸形、成活率下降。極端的孵化溫度還可能會造成后期發(fā)育過程中生存能力降低，比如早期孵化的青蛙后肢較短和跳躍能力較弱，造成躲避天敵和捕食能力下降[34]；然而有對林蛙的研究表明，在蝌蚪期因外界溫度差異造成的蝌蚪耐熱性的差異可能不會延續(xù)到變態(tài)之后[35]。綜上，不同水溫會對黑斑蛙胚胎發(fā)育指標產(chǎn)生顯著影響。

4 結(jié) 論

本試驗研究表明，黑斑蛙胚胎發(fā)育的最適水溫為24～27 ℃。當水溫偏離24～27 ℃時，會引起黑斑蛙胚胎成活率的顯著下降，體質(zhì)量、體長、尾長、體寬等指標也有降低的趨勢。