呂 可，趙前程，劉婧懿，馬子禎，徐永平，馬永生

( 1.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024 )

水產(chǎn)品為人類提供了17%的動(dòng)物蛋白攝入，其中約50%來(lái)自水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。2014年世界水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量為7.380×107t，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對(duì)人類水產(chǎn)品消費(fèi)的貢獻(xiàn)首次超過(guò)野生水產(chǎn)品捕撈[1]。我國(guó)是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，2018年全國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖量為4.991×107t，水產(chǎn)養(yǎng)殖量占世界總量的60%以上[2]。然而，集約化養(yǎng)殖模式不可避免帶來(lái)養(yǎng)殖環(huán)境污染和水產(chǎn)動(dòng)物病害頻發(fā)的問(wèn)題。全國(guó)每年因病害造成的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失約為150億元，并以細(xì)菌性疾病為主，約占全部病害經(jīng)濟(jì)損失的50%以上[3]。

長(zhǎng)期以來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性病害的防治主要依賴于抗生素(包括人工合成抗菌藥物)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1996—2013年我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中曾報(bào)道使用的抗生素有8大類，共計(jì)20個(gè)品種，目前有11個(gè)品種被批準(zhǔn)允許應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[4-5]。但抗生素的大量使用，帶來(lái)了水產(chǎn)品藥物殘留、細(xì)菌耐藥性和環(huán)境污染等突出問(wèn)題。研發(fā)新型抗生素替代品乃迫切之需，一些具有潛在應(yīng)用前景的抗生素替代品相繼被開發(fā)應(yīng)用，如寡聚糖、益生菌、天然植物提取物及噬菌體等。

噬菌體是一類細(xì)菌性病毒，其中烈性噬菌體在感染宿主菌后能在較短時(shí)間內(nèi)完成復(fù)制周期，并裂解宿主菌釋放子代病毒顆粒，從而達(dá)到抗菌效果。噬菌體是一種極具潛力的抗生素替代品，且已在陸生動(dòng)物和水生動(dòng)物病害防治中顯示出良好的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)的抗生素相比，噬菌體具有專一性強(qiáng)、可自我復(fù)制增殖、來(lái)源豐富、篩選方便等突出優(yōu)勢(shì)。筆者綜述了目前國(guó)內(nèi)外噬菌體在魚、蝦、貝類等水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中的最新研究概況、存在的問(wèn)題及解決策略，旨在為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展綠色生態(tài)防控技術(shù)提供新思路。

1 噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害防治中的應(yīng)用研究

早在20世紀(jì)80年代，Wu等[6]首先提出用噬菌體防治嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，并證實(shí)了噬菌體的體外殺菌效果，但并未通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證。Nakai等[7]首次研究了噬菌體對(duì)黃條(Seriolaaureovittata)幼魚格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)感染的治療效果。試驗(yàn)先對(duì)黃條腹腔注射格氏乳球菌攻毒，隨后立即腹腔注射1.6×107pfu的噬菌體PLgY-16，10 d后病魚的存活率由10%升至100%，可見噬菌體具有顯著治療效果。隨后，噬菌體被陸續(xù)嘗試用于防治香魚(Plecoglossusaltivelis)冷水病[8]、大西洋鮭(Salmosalar)殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)感染[9]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)發(fā)光病[10]，以及皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)[11]和仿刺參(Apostichopusjaponicus)弧菌病[12]等，相關(guān)代表性研究見表1。

迄今，大多數(shù)研究是以人工攻毒感染的動(dòng)物為模型，再將噬菌體以口服、浸浴、腹腔或肌肉注射等方式給藥，后根據(jù)動(dòng)物的發(fā)病率或存活率來(lái)判斷噬菌體的防治效果。如在魚類養(yǎng)殖中，Park等[13]對(duì)香魚口服變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)攻毒后，立即飼喂PPpW-3、PPpW-4兩種噬菌體的混合物，兩周后香魚死亡率從65.0%降至22.5%；Higuera等[14]用5×105cfu/mL鰻弧菌(Vibrioanguillarum)Va PF4對(duì)大西洋鮭進(jìn)行浸浴攻毒，同時(shí)按感染復(fù)數(shù)為1和20的劑量加入噬菌體CHOED，魚的存活率由7%升至100%。在對(duì)蝦養(yǎng)殖中，Karunasagar等[10]針對(duì)哈維氏弧菌(V.harvey)引起的對(duì)蝦發(fā)光弧菌病，在攻毒后每隔1 d用2×106pfu/mL噬菌體Viha10和Viha8浸浴，斑節(jié)對(duì)蝦幼體存活率與抗生素治療組相比由65%升至88%。在貝類養(yǎng)殖中，李太武等[11]對(duì)皺紋盤鮑足部肌肉注射河流弧菌(V.flauvialis)進(jìn)行攻毒，同時(shí)以感染復(fù)數(shù)為10的劑量注射噬菌體，7 d后與對(duì)照組相比，皺紋盤鮑的死亡率由70%降至20%?？傮w可見，噬菌體能顯著提高攻毒感染動(dòng)物的存活率，具有較顯著的防治效果。

但也有個(gè)別研究顯示噬菌體對(duì)魚類病害無(wú)防治效果。Verner Jeffreys等[9]以被殺鮭氣單胞菌攻毒感染的大西洋鮭為模型，將3株噬菌體O、R、B混合制成“雞尾酒”制劑，再對(duì)魚進(jìn)行飼喂、浸浴和腹腔注射噬菌體，均未能降低大西洋鮭的死亡率?？梢姡绊懯删w體內(nèi)作用效果的因素較為復(fù)雜，對(duì)噬菌體治療失敗的原因尚有待深入研究。

表1 噬菌體防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病的研究Tab.1 Application of bacteriophages in treatment of bacterial diseases in animals in aquaculture

2 噬菌體療法尚存在的問(wèn)題及解決策略

2.1 噬菌體的裂解宿主譜窄

噬菌體裂解細(xì)菌的作用，具有嚴(yán)格的宿主特異性，一般僅限于細(xì)菌分類學(xué)上“種”的界限之內(nèi)，大多噬菌體僅對(duì)某種細(xì)菌里的某些特定株有裂解作用，這種專一性要求噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用時(shí)需預(yù)先建有能涵蓋各種病原菌的噬菌體庫(kù)，且能夠快速診斷出病原及其噬菌體易感性。

目前解決噬菌體裂解譜窄的常見方法是“雞尾酒”法，即將針對(duì)同種宿主菌的幾株不同噬菌體混合后聯(lián)合應(yīng)用，如用于控制肉制品中李斯特菌(Listera)的LixtexTMP100為6株單增李斯特菌(L.monocytogenes)噬菌體的混合物[24]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，仿刺參“化皮病”的病原也具有多樣性的特點(diǎn)，如燦爛弧菌(V.splendidus)、溶藻弧菌及殺鮭氣單胞菌等均曾被證實(shí)能引起仿刺參化皮，但目前噬菌體用于仿刺參化皮的研究?jī)H針對(duì)弧菌，尚未見將不同宿主的噬菌體混合后使用。

值得注意的是，自然界分離到的少數(shù)噬菌體株具有寬譜特性，這在腸桿菌和葡萄球菌噬菌體中較為常見。一些弧菌噬菌體也顯示出寬譜特性，如噬菌體KVP40能同時(shí)裂解8種弧菌，其中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌和燦爛弧菌等，甚至能跨出“屬”的界限裂解鰒發(fā)光桿菌(Photobacteriumleiognathid)[25]；與此類似，鰻弧菌噬菌體CHOED也能裂解病海魚弧菌(V.ordalii)[14]?？梢?，篩選寬譜噬菌體也是解決噬菌體宿主譜的一種可行方案。

此外，噬菌體的特異性基于其尾絲蛋白與宿主菌表面受體的專一性結(jié)合，對(duì)噬菌體進(jìn)行基因工程改造，特別是其尾絲蛋白部分，也能有效拓寬其宿主譜。如T2噬菌體僅能裂解7%的大腸桿菌分離株，利用同源重組的方法將T2尾絲蛋白基因gp37和gp38與另一株寬譜噬菌體IP008替換，這種改造后的T2噬菌體宿主譜明顯變寬，能裂解33%的大腸桿菌分離株[26]。

2.2 病原菌易對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性

細(xì)菌易對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性，這可能是限制噬菌體作用效果的關(guān)鍵因素。噬菌體完成一個(gè)復(fù)制周期需經(jīng)吸附、核酸注入、核酸復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)生物合成、裝配及釋放幾個(gè)步驟，宿主菌阻礙其中任一步驟即可產(chǎn)生抗性，如阻礙噬菌體吸附、抑制噬菌體核酸注入、切割噬菌體核酸及流產(chǎn)感染系統(tǒng)等[27]。

在體外培養(yǎng)物中，噬菌體抗性菌株在數(shù)小時(shí)或數(shù)日內(nèi)即可出現(xiàn)。將多株噬菌體混合后的“雞尾酒”法雖能有效延緩噬菌體抗性菌株的產(chǎn)生，但仍難以完全消除培養(yǎng)物中的宿主菌。與持留菌對(duì)抗生素耐藥類似[28]，筆者推斷細(xì)菌群體中存在一小部分生長(zhǎng)緩慢、代謝活動(dòng)弱的亞群，雖未發(fā)生基因抗性突變，但對(duì)噬菌體不敏感。這些持留菌接種到新的培養(yǎng)基中可再次生長(zhǎng)起來(lái)，又呈現(xiàn)出大部分細(xì)菌能夠被噬菌體殺死，僅有一小部分存活下來(lái)的情況。

不過(guò)在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境下，病原菌會(huì)遇到復(fù)雜多樣的選擇性壓力，如營(yíng)養(yǎng)缺乏、其他微生物競(jìng)爭(zhēng)及宿主免疫防御等，噬菌體抗性菌株并不易出現(xiàn)。Nakai等[7]從經(jīng)噬菌體處理的黃條體內(nèi)分離的所有格氏乳球菌對(duì)噬菌體PLgY-16依然敏感；與此類似，Park等[13]從經(jīng)噬菌體處理后但仍然病死的香魚體內(nèi)也未分離出噬菌體抗性突變菌株。這也提示體內(nèi)細(xì)菌在沒有發(fā)生抗性突變的情況下也能逃避噬菌體的裂解，單一應(yīng)用噬菌體難以完全清除體內(nèi)病原菌。

值得注意的是，某些細(xì)菌的毒力因子也是噬菌體的吸附受體，如脂多糖、外膜蛋白或莢膜等。致病菌株可以通過(guò)受體突變?nèi)笔Щ蚪Y(jié)構(gòu)變化對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性，這時(shí)會(huì)伴隨著毒力下降，或?qū)股馗用舾校憩F(xiàn)出進(jìn)化生物學(xué)中的權(quán)衡現(xiàn)象。如變形假單胞菌野生分離株對(duì)香魚的半致死劑量為101.2cfu/尾，而噬菌體抗性突變株對(duì)香魚的半致死劑量>104cfu/尾，毒力顯著降低，但具體原因并未闡明[13]。Chan等[29]研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體OMKO1以銅綠假單胞菌外排泵Mex AB-OprM上的外膜通道蛋白OprM為吸附受體，在噬菌體的選擇壓力下，銅綠假單胞菌OprM基因突變，外排泵功能喪失，導(dǎo)致對(duì)幾種抗生素類藥物的敏感性增加，這為噬菌體與抗生素組合使用提供了理論依據(jù)。

2.3 噬菌體的給藥途徑

水產(chǎn)養(yǎng)殖中噬菌體的給藥途徑有腹腔或肌肉注射、通過(guò)飼料口服以及浸浴，針對(duì)一些體表外傷，也有涂抹法[15]。但注射、涂抹給藥方式可操作性差，可行的給藥途徑是通過(guò)飼料口服或浸浴。

口服噬菌體首先需要解決胃酸屏障問(wèn)題。除少數(shù)噬菌體(如λ噬菌體)對(duì)酸有較強(qiáng)耐酸性外，大部分噬菌體對(duì)酸敏感，一般在pH<3.0時(shí)迅速失活。與陸生動(dòng)物相比，魚的胃液pH相對(duì)較高，特別是一些幼魚，如黃條幼魚胃液pH在5.2～6.0間變化[7]，口服噬菌體能夠穩(wěn)定穿過(guò)胃酸屏障。但對(duì)一些胃液酸性較強(qiáng)的魚類而言[如虹鱒(Oncorhynchusmykiss)，靜息狀態(tài)下胃液pH為2.7[30]，口服噬菌體易遭胃液破壞而喪失抗菌活性。在陸生動(dòng)物中，目前解決胃酸屏障的方法有2種:(1)使用抗酸劑中和胃酸，如CaCO3、Mg(OH)2等，或用雷尼替丁和奧美拉唑等藥物來(lái)抑制胃酸分泌[31]；(2)對(duì)噬菌體進(jìn)行微囊化包埋，Ma等[32-33]曾用靜電振動(dòng)噴嘴—離子絡(luò)合凝膠法分別制備出海藻酸鈣/殼聚糖微球、海藻酸鈣/乳清蛋白微球以及摻雜CaCO3無(wú)機(jī)微粒的海藻酸鈣微球，成功用于噬菌體Felix O1和噬菌體K的包埋，有效解決了口服噬菌體在動(dòng)物胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性問(wèn)題。這幾種微球在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中的應(yīng)用是筆者所在團(tuán)隊(duì)目前正在進(jìn)行的工作。

口服噬菌體一般主要針對(duì)動(dòng)物胃腸道感染，但噬菌體不能黏附或定殖于動(dòng)物腸道中，故很快會(huì)被排出體外。不過(guò)，也有部分噬菌體可穿過(guò)動(dòng)物腸黏膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，如口服變形假單胞菌噬菌體PPpW-3和PPpW-4能進(jìn)入香魚循環(huán)系統(tǒng)，并轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)腸、腎、脾等組織器官，消減感染組織中的病原菌；與此類似，口服噬菌體A5/80可以進(jìn)入大鼠血液循環(huán)，不過(guò)口服T4卻不能[31]?？诜删w從動(dòng)物腸道進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的機(jī)制目前尚未完全闡明，可能是通過(guò)類似細(xì)菌腸道移位的過(guò)程實(shí)現(xiàn)，且決定噬菌體能否移位的因素包括多個(gè)方面，如噬菌體衣殼蛋白的序列，與腸道免疫細(xì)胞的相互作用等[34]。

然而口服給藥對(duì)處育苗階段或感染后不攝食的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物難以適用，浸浴法是另一種較為理想的給藥方式。水體中噬菌體易與目標(biāo)宿主菌株碰撞吸附，這對(duì)控制通過(guò)皮膚和鰓組織侵染的水產(chǎn)致病菌更具優(yōu)勢(shì)。不過(guò)，目前這種方法僅限于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下封閉水體中的應(yīng)用，是否適應(yīng)于大規(guī)模開放水域還有待進(jìn)一步研究。

2.4 噬菌體的給藥劑量

噬菌體能夠自我復(fù)制增殖，若噬菌體在一個(gè)裂解周期內(nèi)產(chǎn)生200個(gè)子代病毒顆粒，那么理論上它將以200n方式進(jìn)行指數(shù)增殖[35]，這意味著單次給藥即可實(shí)現(xiàn)理想治療效果；而抗生素類小分子藥物由于體內(nèi)的代謝消除作用[36-37]，一般需重復(fù)多次給藥方可達(dá)到藥效。Smith等[38]曾以經(jīng)大腸桿菌(O18ac:H7:K1)攻毒感染的小鼠為模型，證實(shí)了單劑量噬菌體治療效果顯著優(yōu)于多劑量的抗生素，其中包括氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素和磺胺異惡唑。

但很多研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體感染復(fù)數(shù)越大，對(duì)動(dòng)物保護(hù)效果愈佳，在低劑量時(shí)常無(wú)防治效果。Zhang等[12]將PVA1和PVA2兩株噬菌體混合后，對(duì)仿刺參進(jìn)行腹腔注射，在感染復(fù)數(shù)分別為10、1、0.1時(shí)，可將攻毒感染仿刺參的存活率由3%分別提升至73%、50%和47%。Madsen等[39]向虹鱒幼苗腹腔注射104cfu/尾嗜冷黃桿菌(Flavobacteriumpsychrophilum)，再腹腔注射104pfu/尾噬菌體FpV-9，未能提高魚的存活率。這些研究均表明，噬菌體在低劑量給藥時(shí)無(wú)治療效果，可能的解釋是體內(nèi)環(huán)境下的大多數(shù)宿主細(xì)菌處于生長(zhǎng)緩慢或停滯的生理狀態(tài)，噬菌體對(duì)其吸附感染能力下降，僅能通過(guò)初級(jí)感染方式完成殺菌作用。可見，噬菌體合理給藥劑量目前仍難以確定，而這有待于未來(lái)噬菌體在不同水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征的闡明。

2.5 噬菌體的給藥時(shí)間

噬菌體的治療效果與其給藥時(shí)間密切相關(guān)，一般動(dòng)物感染后噬菌體制劑應(yīng)用越早，存活率越高。在動(dòng)物感染后期，噬菌體的治療效果很有限。Nakai等[7]對(duì)黃條腹腔注射格氏乳球菌攻毒，并于攻毒后0、1、24 h分別腹腔注射1.6×107pfu/尾劑量的噬菌體PLgY-16進(jìn)行治療，10 d內(nèi)感染魚的存活率分別為100%、80%和50%。與此類似，鹵蟲(Artemiafranciscana)無(wú)節(jié)幼體被副溶血性弧菌感染后立即加入噬菌體Vpms1，其存活率為88%；但攻毒后延遲5 h加入噬菌體，鹵蟲存活率則僅為5.8%[40]。近年Roach等[41]提出了“免疫噬菌體協(xié)同作用”的概念，并證實(shí)噬菌體治療小鼠銅綠假單胞菌感染需要其非特異免疫系統(tǒng)的協(xié)助。據(jù)此，筆者推測(cè)動(dòng)物自身的免疫系統(tǒng)可能對(duì)噬菌體防治效果發(fā)揮關(guān)鍵作用，在感染后期，動(dòng)物免疫功能低下或受損，噬菌體治療難以奏效。

此外，噬菌體病毒顆粒難以進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，而在感染后期，某些病原菌能侵入胞內(nèi)逃避噬菌體的裂解，如遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、沙門氏菌(Salmonella)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)等。目前一種可行的解決策略是以減毒宿主菌作為載體將噬菌體導(dǎo)入胞內(nèi)，如以減毒恥垢分支桿菌(M.smegmatis)為載體，攜帶噬菌體TM4進(jìn)入巨噬細(xì)胞，可顯著降低小鼠脾臟巨噬細(xì)胞內(nèi)的分支桿菌數(shù)量[42]，但這種方法還有待于在其他噬菌體及宿主系統(tǒng)中驗(yàn)證。

2.6 噬菌體在水產(chǎn)動(dòng)物中的藥代動(dòng)力學(xué)特征尚未闡明

噬菌體是一種依賴宿主菌、能自我復(fù)制的病毒顆粒，它在魚體內(nèi)的吸收分布規(guī)律及代謝動(dòng)力學(xué)特征目前尚未完全闡明。與抗生素小分子藥物相比，噬菌體在動(dòng)物體內(nèi)抗菌作用過(guò)程中具有兩個(gè)顯著特點(diǎn)：一是噬菌體能夠在體內(nèi)自我復(fù)制增殖；二是噬菌體作為異源物質(zhì)具有免疫原性，可能會(huì)刺激魚機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體可能會(huì)對(duì)噬菌體產(chǎn)生消除作用。這兩個(gè)特征致使噬菌體的體內(nèi)吸收分布規(guī)律及代謝動(dòng)力學(xué)特征難以被準(zhǔn)確描述。Payne等[43]建立了預(yù)測(cè)噬菌體體內(nèi)群體動(dòng)力學(xué)的數(shù)學(xué)模型，指出噬菌體初始給藥劑量、治療時(shí)間及宿主菌密度是決定治療成敗的關(guān)鍵，但此模型是基于噬菌體的體外生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，是否適用于動(dòng)物體內(nèi)尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

與高等脊椎動(dòng)物相似，魚類免疫組織包括分布于胸腺、脾臟等器官中的系統(tǒng)淋巴組織和存在于腸、鰓等器官中的黏膜淋巴組織[44]。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射噬菌體會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，且影響噬菌體的體內(nèi)裂菌效果[45]。最近研究發(fā)現(xiàn)，口服噬菌體能刺激小鼠腸黏膜免疫應(yīng)答產(chǎn)生分泌型抗體IgA，顯著降低了噬菌體活性[46]。此外，機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)也能將噬菌體從循環(huán)系統(tǒng)中清除[47]。但魚機(jī)體的免疫反應(yīng)對(duì)體內(nèi)噬菌體的吸收分布及消除過(guò)程的影響還是個(gè)未知問(wèn)題。有研究發(fā)現(xiàn)，香魚口服或肌內(nèi)注射變形假單胞菌噬菌體PPpW-3、PPpW-4后，血清中均未檢出能中和噬菌體的抗體，其原因可能是這些噬菌體分離株對(duì)香魚的免疫原性低，或是給藥劑量過(guò)低[13]。

同種宿主不同噬菌體間的免疫原性相差很大，如大腸桿菌T4噬菌體免疫原性大于T1和T5[48]，這提示，可以針對(duì)某特定宿主菌篩選出免疫原性較低的噬菌體。Merril等[47]就曾采用體內(nèi)連續(xù)傳代的方法，篩選出能在循環(huán)系統(tǒng)長(zhǎng)期存活的噬菌體突變株，這為解決噬菌體免疫原性問(wèn)題提供了思路。此外，目前蛋白類藥物可通過(guò)聚乙二醇修飾的方法降低免疫原性，從而延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期；與此類似，Kim等[49]用單甲氧基聚乙二醇修飾噬菌體后，也能有效延長(zhǎng)噬菌體在血液中的循環(huán)時(shí)間并阻止其被免疫系統(tǒng)快速清除。

值得提出的是，對(duì)一些缺乏特異性免疫系統(tǒng)的低等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，如仿刺參，噬菌體應(yīng)用時(shí)受宿主免疫系統(tǒng)影響較小。Li等[50]研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體能通過(guò)浸浴途徑進(jìn)入仿刺參體腔液并較長(zhǎng)時(shí)間滯留，且活性不受超氧化物歧化酶和溶菌酶等非特異性免疫因子的影響。

2.7 噬菌體應(yīng)用的安全性問(wèn)題

噬菌體在自然界中無(wú)處不在，凡有原核生物活動(dòng)的地方幾乎都發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)的噬菌體存在，據(jù)估計(jì)地球生物圈中噬菌體數(shù)目高達(dá)1030～1032個(gè)[51]，尤其以海洋中的噬菌體數(shù)目和種類最多，如在表層海水中噬菌體的豐度達(dá)到近107個(gè)/mL，是細(xì)菌豐度的5～25倍[52]。此外，人和動(dòng)物體內(nèi)就寄居著各種噬菌體，如人的胃腸道、尿道、皮膚以及口腔中均有噬菌體存在[53-54]。因此，噬菌體是人或動(dòng)物體內(nèi)的正常共棲生物體，安全性毋庸置疑。目前已有多個(gè)噬菌體產(chǎn)品被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為公認(rèn)安全級(jí)產(chǎn)品，如荷蘭Micreos Food Safety公司的ListexTMP100[24]，美國(guó)Intralytix公司的SalmoFreshTM等[55]。

但是，部分溫和噬菌體攜帶一些編碼毒力因子的結(jié)構(gòu)基因，可整合到宿主菌的基因組上，賦予其產(chǎn)毒能力，如霍亂弧菌(V.cholerae)和擬態(tài)弧菌(V.mimicus)的主要毒力因子霍亂毒素就是由絲狀噬菌體CTXΦ攜帶的ctxAB基因所編碼[56]；且溶源性霍亂弧菌中的前噬菌體CTXΦ在受到外界理化因素誘導(dǎo)后，可脫離宿主產(chǎn)生成熟的噬菌體顆粒CTXΦ，它又會(huì)侵染新的無(wú)毒菌株，這樣就造成了ctxAB基因在菌株間的水平擴(kuò)散。同樣，目前還在哈維弧菌和副溶血弧菌中發(fā)現(xiàn)有溶源性噬菌體，且哈維弧菌對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的致病性也與噬菌體相關(guān)[57]。另外，溫和噬菌體還通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用傳遞抗生素耐藥基因[58]。因此，在應(yīng)用噬菌體之前需對(duì)噬菌體的基因組進(jìn)行測(cè)序，以排除噬菌體攜帶毒素基因或抗生素耐藥基因的可能性；同時(shí)，也可通過(guò)噬菌體是否攜帶阻遏蛋白和整合酶基因來(lái)初步判斷其溶源性。

目前可采用基因工程手段將溫和噬菌體改造為烈性噬菌體。Dedrick等[59]為侵染膿腫分枝桿菌(M.abscessus)的溫和噬菌體，通過(guò)基因工程手段將其阻遏蛋白基因gene45敲除后，使其喪失溶源能力而變?yōu)榱倚允删w；此株噬菌體最近被首次用來(lái)治療人分枝桿菌感染，可讓患者癥狀明顯緩解[60]。

噬菌體將體內(nèi)感染病灶處革蘭氏陰性細(xì)菌裂解后，短時(shí)間內(nèi)引起細(xì)胞外膜層內(nèi)毒素的大量釋放，這對(duì)哺乳動(dòng)物而言，存在產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥的風(fēng)險(xiǎn)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，脂多糖常被用來(lái)提高魚類的非特異免疫力，但超過(guò)安全劑量時(shí)同樣對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物具有較強(qiáng)毒性作用[61]。Verner Jeffreys等[9]給大西洋鮭腹腔注射噬菌體懸液，其中內(nèi)毒素含量達(dá)106～107EU/mL，并未發(fā)現(xiàn)對(duì)魚產(chǎn)生不良影響，這可能是由于不同菌種來(lái)源的內(nèi)毒素性質(zhì)不同，且不同水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)內(nèi)毒素的敏感性也存在差異。

一些噬菌體突變株能感染殺死細(xì)菌，但未引起細(xì)胞裂解。如T4噬菌體表達(dá)穿孔素的基因t發(fā)生琥珀突變后(此突變株命名為L(zhǎng)ysD)，穿孔素不能正常表達(dá)，無(wú)法在細(xì)胞膜上形成跨膜孔，這樣裂解酶不能穿過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)肽聚糖層發(fā)揮溶菌作用，也就避免了內(nèi)毒素的釋放[62]。噬菌體LysD能有效治療小鼠大腸桿菌性腹膜炎，并降低炎癥因子腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6的水平，這為一些水產(chǎn)用噬菌體的基因工程改造提供了新思路。

3 結(jié)論與展望

為適應(yīng)我國(guó)漁業(yè)轉(zhuǎn)方式、調(diào)結(jié)構(gòu)的發(fā)展要求，并從根本上解決水產(chǎn)品的質(zhì)量安全問(wèn)題，2017年我國(guó)農(nóng)業(yè)部開始在部分地區(qū)實(shí)施“漁藥減量行動(dòng)”，著力推進(jìn)水生動(dòng)物病害防控方式向綠色、生態(tài)和環(huán)保的方向轉(zhuǎn)變。在此背景下，噬菌體作為抗生素替代品應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖以顯示出其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和巨大潛力。但若將噬菌體像抗生素一樣規(guī)?；茝V使用，仍有諸多問(wèn)題需要解決。如噬菌體在不同水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征亟需闡明，以科學(xué)確定噬菌體的給藥方式、給藥劑量和給藥時(shí)間；噬菌體是否會(huì)介導(dǎo)毒力或抗生素耐藥基因轉(zhuǎn)移到非靶細(xì)菌上。噬菌體若作為生物制品投入市場(chǎng)，需要通過(guò)國(guó)家藥監(jiān)部門嚴(yán)格的監(jiān)管批準(zhǔn)，同時(shí)也要考慮消費(fèi)者對(duì)噬菌體處理產(chǎn)品的接受程度。