楊進山，趙文超，侯鈺穎，李 萌，張琴林，王紹輝

(北京農(nóng)學院 植物科學技術(shù)學院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室,北京 102206)

根結(jié)線蟲病是設(shè)施番茄生產(chǎn)中一種常見的土傳病害，受現(xiàn)實條件影響，防治難度高，這導致設(shè)施中番茄根結(jié)線蟲病日益加重，病害嚴重時甚至導致絕收[1,2]。殺線劑是現(xiàn)階段防治根結(jié)線蟲的有效手段之一，主要包括克百威、滅線磷、涕滅威等，但是這些藥劑對人和環(huán)境造成一定傷害。隨著中國環(huán)保意識的不斷提高，法律規(guī)制度逐漸健全，綠色、安全的殺線劑越來越被人們關(guān)注和青睞。

近些年來，關(guān)于植物源的殺線劑正在受到人們的追捧，關(guān)于植物根系分泌物對抵抗根結(jié)線蟲報道也越來越多。楊國棟等的研究發(fā)現(xiàn)，抗性番茄的根系分泌物對RKN排斥作用，感性番茄根系分泌物則對對RKN吸引作用[3]。王艷艷等在研究黃瓜根系分泌物時發(fā)現(xiàn)高抗砧木的根系分泌物可以抑制線蟲的卵孵化[4]。Degenhardt等研究發(fā)現(xiàn)在玉米的根系分泌物中鑒定出(E)-β-石竹烯能夠吸引根結(jié)線蟲[5]。Hooks等研究發(fā)現(xiàn)菊科植物根系分泌物中的β-三聯(lián)噻吩可以排斥根結(jié)線蟲[6]。

經(jīng)過前期的根系分泌物代謝組分析，發(fā)現(xiàn)番茄株系根系分泌物中含有一種叫加巴噴丁的物質(zhì)，并且該化學物質(zhì)可通過商業(yè)手段購得。不同濃度梯度的加巴噴丁溶液對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)進行趨化性和死亡率試驗，體外篩選出對J2有抑制作用的濃度，以此來推測其運用于生產(chǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

番茄品種為CM植株，番茄株系原始種子由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所(北京)李傳友研究員惠贈。

1.2 方 法

1.2.1 番茄幼苗的培養(yǎng)與管理 采用溫湯浸種法使種子萌發(fā)，待大部分種子“露白”后在穴盤中播種，育苗室中培養(yǎng)。育苗室的溫光設(shè)置為：晝夜溫度為26 ℃/18 ℃，光照期為16 h，暗期為8 h。根據(jù)番茄幼苗的生長狀況，適時補充營養(yǎng)液，及時澆水通風。

1.2.2 南方根結(jié)線蟲的繁殖與管理 根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincongnita)，由農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室自繁。將實驗室易感番茄植株根系上淡黃色卵塊挑下后蒸餾水清洗干凈并消毒，放置在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育，24～72 h內(nèi)不斷觀察，挑選活力強的J2用于趨化性和致死率試驗。

1.2.3 根系分泌物的收集及鑒定 采用浸根法收集番茄根系分泌物，用Herz等開發(fā)的方法收集根系分泌物[7]。將完整的根放在裝有150 mL蒸餾水并且用錫箔紙包裹的燒杯中。每4 h更換1次水，收集1次。為了進一步分析，將滲出液過濾并濃縮至5 mL。待番茄植株長至4葉1心時進行分泌物收集試驗，每處理6株重復。收集的分泌物經(jīng)過過濾、濃縮后采用LC-MS與GC-MS技術(shù)鑒定、分析根系分泌物的成分組成(北京凡星博奧生物技術(shù)有限公司測定)。

通過液相色譜-質(zhì)譜法進行檢測。色譜方法：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，2.1 mm×100 mm，3.5 μm。柱溫35 ℃，進樣量3 μL，流速0.5 mL/min。質(zhì)譜方法為：電噴霧電離( ESI) 源，正負離子電離模式。離子源溫度(120 ℃，脫溶劑溫度500 ℃，脫溶劑氮氣流600 L/h，錐孔反吹氮氣50 L/ h。正負離子模式毛細管電離電壓分別為3.0 kV和4.5 kV，取樣錐孔電壓為27 eV，萃取錐孔4 eV，四極桿掃描范圍m/z50～1 500。使用Analysis TF 1.6和MarkerView 1.2.1軟件(美國AB SCIEX)進行數(shù)據(jù)收集，并使用MetaboAnalyst 3.0軟件對差異化合物進行分析和篩選。差異化合物的篩選標準為FC>1.5 or <0.67,P<0.05,VIP>1。將選定的差異化合物與HMDB(人類代謝組數(shù)據(jù)庫)數(shù)據(jù)庫進行比較，以確定特定物質(zhì)。

1.2.4 J2趨化性試驗 將直徑為5 cm的培養(yǎng)皿底部通過兩個內(nèi)外環(huán)劃分成16部分。先在培養(yǎng)皿中倒入0.8 %瓊脂糖約5 mL，待凝固后備用。在RE區(qū)域內(nèi)加入20 μL待測的根系分泌物或加巴噴丁溶液，將20 μL內(nèi)含有約30頭J2懸浮液接種于中心環(huán)N區(qū)域，在26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗放置24 h。在顯微鏡下分別統(tǒng)計1～8區(qū)及中心N區(qū)域的根結(jié)線蟲數(shù)量[8]。

吸引指數(shù)=1～8區(qū)域J2總數(shù)/(N區(qū)域J2總數(shù)-1～8區(qū)域J2總數(shù))×100%。

1.2.5 J2死亡率試驗 在12孔板上對不同濃度(1、0.1、0.01 mM)的加巴噴丁溶液進行J2死亡率試驗，每種濃度試驗6次。至少進行了3次獨立試驗[8]。對照組由乙醇和蒸餾水組成。在加入不同濃度的加巴噴丁之前，每個孔加入20 μL含有30～50頭 J2s的液滴。在26 ℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)24 h后，用40倍顯微鏡計數(shù)不活動線蟲數(shù)量用于計算死亡率。

死亡率=不活動線蟲數(shù)量/總線蟲數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄根系分泌物代謝組結(jié)果分析

通過對收集的番茄根系分泌物進行代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，在根系分泌物中含有多種成分。根系分泌物的主要成分一共檢測到2 000多種物質(zhì)，其中主要包含氨基酸，肽及其類似物，苯醚類，苯酚類，苯甲酸及其衍生物，β-羥基酸及其衍生物，膽汁醇、酸及其衍生物，碳水化合物及其結(jié)合物等。對這些物質(zhì)進行篩選后將可購得的物質(zhì)進行后續(xù)試驗(表1為番茄分泌物成分部分)。其中，在根系分泌物中加巴噴丁是存在其中的，其相對含量為80.626 2。加巴噴丁在根系分泌物中并不是含量最多的物質(zhì)，相對其他物質(zhì)來說其含量很少，其所起的作用可能和其含量關(guān)系不大。該物質(zhì)的核質(zhì)比為172.131，CAS號為60142-96-3，室溫下呈白色粉末至灰白色結(jié)晶粉末，其理化性質(zhì)穩(wěn)定。

表1 番茄分泌物代謝組部分信息

2.2 趨化性結(jié)果分析

如表2所示，通過對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)進行趨化性試驗發(fā)現(xiàn)，當Gabapentin溶液的濃度為1 mM時，對J2有明顯的排斥作用；當濃度稀釋至0.1、0.01 mM時，Gabapentin對J2無明顯吸引或是排斥現(xiàn)象，對照表現(xiàn)出相同現(xiàn)象。

表2 根系分泌物及不同濃度加巴噴丁對J2的趨化性

2.3 J2死亡率結(jié)果分析

如圖1所示，通過對J2進行死亡率試驗時發(fā)現(xiàn)，當濃度為1 mM和0.1 mM時，24 h線蟲死亡率分別達到93%、95%；當濃度為0.01 mM和0.001 mM時，24 h線蟲死亡率分別為72%、75%；當濃度稀釋到0.000 1 mM時死亡率下降到26%，雖然與對照相比仍有顯著差異，但是由于死亡率已經(jīng)低于50%，致死作用弱。

圖1 不同濃度加巴噴丁對J2的致死率比較(P<0.01)

綜上所述，通過LC/GC-MS發(fā)現(xiàn)在番茄根系分泌物中含有一種名為加巴噴丁的化學物質(zhì)，該物質(zhì)室溫下化學性質(zhì)穩(wěn)定；通過J2體外趨化性和死亡率試驗發(fā)現(xiàn)，當加巴噴丁溶液濃度為1 mM時，對J2有明顯的排斥作用并且J2死亡率高達92 %；當濃度為0.1～0.001 mM時，加巴噴丁溶液對J2無明顯排斥現(xiàn)象，但J2的死亡率依舊超過70%。這說明加巴噴丁溶液在濃度為1 mM時對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)有明顯的抑制作用。

3 討 論

目前來說，人們越來越重視農(nóng)作物生產(chǎn)過程中的綠色、安全問題。有報道指出原來使用廣泛的殺線劑克百威、滅線磷、涕滅威可以明顯的減少線蟲的遷移、侵染和取食，進而減少線蟲對作物和蔬菜的危害，但是這些物質(zhì)的高毒性對其它有益蟲鳥有一定危害，還會對人造成二次毒害。在2018年10月1日后全面禁止克百威、滅線磷、涕滅威已禁止在蔬菜、果樹、茶樹、中草藥材上使用[9]。隨著越來越多高毒性殺線劑被禁止使用，殺線劑的研制也更多的傾向更安全可靠的的植物源化學物質(zhì)上來。先正達的生物殺線蟲劑 Clariva PN(活性成分:巴斯德桿菌PN1，Pasteuria nishizawaePN1) 獲得巴西登記[10]。孟山都將在巴西上市殺線蟲劑NemaStrike(活性成分：tioxazafen)，該活性成分具有低毒性，殺線持久性的特點[10]。關(guān)于根系分泌物對根結(jié)線蟲有影響的研究報道不斷出現(xiàn)。萜類化合物(芫花萜、棉酚等)、類黃酮(黃酮醇等)、糖苷(芥子油苷等)、脂肪酸(丁酸、二烯酸等)和揮發(fā)性有機分子(香油、香葉醇、芳樟醇等)調(diào)節(jié)根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)對植物宿主的吸引和排斥[11,12]；豆科植物和玉米(Zeamays)的根系分泌物可以減緩甚至停止線蟲的運動，以此來降低線蟲感染植物的能力[13]；易感大豆根系分泌物中所包含的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸可吸引大豆孢囊線蟲[14]；柑橘根系分泌物種中的α-松萜、檸檬烯和β-松萜等萜類物質(zhì)可以吸引柑橘根結(jié)線蟲[15,16]；將番茄與茼蒿間作，茼蒿根系分泌物中的月桂酸可以擾亂線蟲中Mi-flp-18基因的表達以阻止其感染番茄[17]。當接種南方根結(jié)線蟲時，L-抗壞血酸2,6-棕櫚酸酯，鄰苯二甲酸二丁酯，鄰苯二甲酸二甲酯和2,6-二叔丁基-對甲酚四種成分顯著增加，這些化合物中的每一種都能抑制南方根結(jié)線蟲的卵孵化，增加了根結(jié)線蟲二齡幼蟲的死亡率[18]。一種植物源的物質(zhì)尸胺對南方根結(jié)線蟲有明顯的吸引作用，該物質(zhì)在番茄的根系分泌物中也有檢測到，但是番茄根系分泌物對南方根結(jié)線蟲并無明顯吸引作用，這可能是由于番茄的根系分泌物中存在某些與之拮抗的物質(zhì)導致[19]。這些研究報道為抗根結(jié)線蟲病指明了研究方向。

通過這些研究以及本試驗可以發(fā)現(xiàn)，開發(fā)植物源的化學物質(zhì)用于抵抗根結(jié)線蟲對番茄株系的入侵的方式是有理可據(jù)的。本試驗中，在1mM濃度下植物源的加巴噴丁溶液對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲(J2)有明顯的排斥作用，并且對J2的死亡率高達到90 %以上，效果是明顯的。加巴噴丁這種物質(zhì)還需要更嚴謹?shù)奶镩g試驗來確定其真正的抗線蟲能力。為了能夠更加有效環(huán)保的防治根結(jié)線蟲病，安全綠色的殺線劑的研究仍是人們前進的方向。