李書(shū)涵，韓瑩琰，郝敬虹，秦曉曉，劉超杰，范雙喜

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

生菜是世界廣泛種植的蔬菜種類(lèi)之一，性喜冷涼，在20～25 ℃時(shí)生長(zhǎng)健壯[1,2]。高溫脅迫是指環(huán)境溫度高于植物適宜生長(zhǎng)溫度10～15 ℃時(shí)，制約植物生長(zhǎng)發(fā)育的現(xiàn)象[3]，生產(chǎn)中，高溫脅迫是影響生菜生長(zhǎng)的主要環(huán)境因素之一[1,2]，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量[4]。全球變暖使高溫脅迫變得越來(lái)越強(qiáng)烈和頻繁[5]。

高溫脅迫下植物細(xì)胞產(chǎn)生大量剩余自由基，致膜脂過(guò)氧化，產(chǎn)生丙二醛，對(duì)植物造成傷害[4]。植物本身具備耐熱性機(jī)制來(lái)減輕這種傷害，抗氧化酶系統(tǒng)是植物的耐熱性機(jī)制之一[6]，通過(guò)調(diào)控自由基清除來(lái)實(shí)現(xiàn)植物在高溫下的存活[7]。抗氧化酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)及抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)。已有研究證實(shí)，抗氧化酶的活性上升可提高植物對(duì)高溫、干旱等逆境的耐受能力[8]。

多胺是生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)低分子量脂肪族含氮堿[9]，可以直接或間接地作為自由基清除劑清除植物組織中的自由基[10]。亞精胺(Spd)是植物中的一種常見(jiàn)的多胺，通過(guò)影響一系列生理生化作用參與調(diào)控各種非生物脅迫。在以往的研究中，外源亞精胺在緩解生姜幼苗[11]、黃瓜幼苗[9]和豇豆幼苗[12]的高溫脅迫傷害中均取得了理想的效果，但在生菜中的作用效果及機(jī)制并不明確。

本試驗(yàn)?zāi)M高溫處理，并對(duì)生菜葉片噴施外源Spd，旨在研究外源Spd調(diào)控生菜的抗氧化酶系統(tǒng)和丙二醛(MDA)減輕生菜逆境傷害的生理生化機(jī)制，為外源亞精胺應(yīng)用到高溫環(huán)境下生菜生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)于2019年4月至2019年8月在北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院進(jìn)行，生菜品種為不耐熱生菜品種‘北散生3號(hào)’。選取飽滿(mǎn)、大小均勻的生菜種子200粒，在晝夜溫度為20 ℃/15 ℃，相對(duì)濕度為70%～75%的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行浸種催芽，48 h后取出播種于穴盤(pán)中，在北京農(nóng)學(xué)院日光溫室中繼續(xù)進(jìn)行培育。生菜幼苗培育至2葉1心時(shí)，單株種植于口徑10 cm、裝滿(mǎn)育苗基質(zhì)的塑料盆中，每2 d澆1次水。在(25±1) ℃下培養(yǎng)至4葉1心時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的植株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)處理，每個(gè)處理15盆，每盆定植1株，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2 方 法

利用可調(diào)控溫度和濕度的兩間小型智能溫室，分別模擬正常和高溫生長(zhǎng)環(huán)境。正常生長(zhǎng)環(huán)境溫室晝夜溫度設(shè)置為20 ℃/15 ℃、光周期為12 h/12 h，光照強(qiáng)度控制為200 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度為70%～75%；模擬高溫生長(zhǎng)環(huán)境的溫室晝夜溫度設(shè)置為30 ℃/25 ℃、光周期為12 h/12 h，光照強(qiáng)度控制為200 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度為70%～75%。

設(shè)置4個(gè)處理:(1)CK: 正常環(huán)境中栽培，葉面噴施蒸餾水；(2)Spd: 正常環(huán)境中栽培，葉面噴施1 mmol·L-1Spd；(3)H: 高溫環(huán)境中栽培，葉面噴施蒸餾水；(4) H+Spd: 高溫環(huán)境中栽培，葉面噴施1 mmol·L-1Spd。

處理中外源Spd的濃度參照李承潔[13]等的研究設(shè)定。處理中蒸餾水和1 mmol·L-1Spd的噴施量以生菜葉面、葉背濕潤(rùn)且液體不滴落為準(zhǔn)。試驗(yàn)處理共進(jìn)行8 d，試劑噴施次數(shù)共計(jì)8次，每天10:00使用小型噴霧器在葉面和葉背均勻噴施去離子水和1 mmol·L-1Spd。處理第0、2、4、6和8天傍晚19:00采集主要功能葉測(cè)定指標(biāo)。

測(cè)定株高、全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量，并取全株鮮質(zhì)量及全株干質(zhì)量計(jì)算植株含水量。

葉片中葉綠素含量測(cè)定采用乙醇、丙酮混液浸提法[14]，丙二醛含量測(cè)定使用硫代巴比妥酸法[15]，過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定使用過(guò)氧化氫紫外分光光度法[16]，過(guò)氧化物酶活性測(cè)定用愈創(chuàng)木酚法[16]，超氧化物歧化酶活性測(cè)定用氮藍(lán)四唑(NBT) 光化學(xué)還原法[16]，抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性測(cè)定使用分光光度法[17]。

數(shù)據(jù)使用SPSS Stastics 18(IBM，美國(guó))進(jìn)行差異顯著性分析(LSD，P<0.05)。圖表均使用Excel 2010(Microsoft，美國(guó))制作完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源亞精胺對(duì)高溫脅迫下生菜生長(zhǎng)的影響

如表1所示，Spd處理的生菜幼苗株高、全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量均與對(duì)照無(wú)顯著差異，植株含水量與對(duì)照有差異，但不顯著。高溫處理下，脅迫時(shí)長(zhǎng)至8d時(shí)，生菜幼苗的全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量、植株含水量顯著減少，但地上部干質(zhì)量、株高與對(duì)照差異不顯著。在高溫脅迫下噴施外源Spd，生菜幼苗的全株鮮質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量均顯著提高，較未噴施Spd相比，分別提高了29.5%和29.0%。但高溫脅迫下噴施外源Spd對(duì)于生菜植株的全株干質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、株高、植株含水量的提升效果不顯著。以上結(jié)果可知，外源噴施Spd能顯著提升生菜幼苗的全株鮮質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量，但對(duì)其全株干質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、株高及植株含水量無(wú)顯著提升效果。

2.2 外源亞精胺對(duì)高溫脅迫下生菜葉片色素含量的影響

如表2所示，與CK相比，Spd處理中生菜葉片的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量均未發(fā)生顯著變化。高溫脅迫至8 d時(shí)，生菜葉片的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量均顯著高于對(duì)照株，分別較對(duì)照提升了84.6%、79.5%和82.4%。在高溫脅迫下噴施Spd，生菜葉片的葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量均與高溫脅迫組無(wú)顯著差異。結(jié)果說(shuō)明，在8 d的處理周期內(nèi)，外源Spd對(duì)高溫脅迫誘導(dǎo)的葉綠素a含量、葉綠素b含量及葉綠素總量的上升現(xiàn)象無(wú)顯著改善。

表1 外源Spd對(duì)高溫脅迫下生菜生長(zhǎng)的影響

表2 外源Spd對(duì)高溫脅迫下生菜葉綠素含量的影響

2.3 外源亞精胺對(duì)高溫脅迫下生菜丙二醛含量的影響

如圖1所示，Spd處理的生菜葉片中丙二醛含量與對(duì)照無(wú)顯著差異，高溫脅迫至4 d時(shí)，生菜葉片中丙二醛含量顯著增加，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，丙二醛含量不斷積累，到達(dá)8 d時(shí)較對(duì)照增加19.25%。在高溫脅迫下噴施外源Spd對(duì)植物葉片中丙二醛含量的影響隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)不同的變化，從6 d開(kāi)始，葉片中丙二醛含量較高溫脅迫組顯著減少，與高溫脅迫相比，6 d和8 d的丙二醛含量分別下降了11.72%和6.25%。以上結(jié)果說(shuō)明，在高溫脅迫下噴施Spd顯著降低了生菜葉片中的MDA水平。

圖1 外源亞精胺對(duì)高溫脅迫下生菜幼苗的丙二醛含量的影響

2.4 外源亞精胺對(duì)高溫脅迫下生菜葉片抗氧化酶活性的影響

如圖2所示，Spd處理的生菜幼苗SOD活性顯著高于對(duì)照，CAT活性與對(duì)照無(wú)顯著差異，POD、APX活性顯著低于對(duì)照。高溫處理下，隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD、CAT活性呈先增后降趨勢(shì)，POD活性呈遞增趨勢(shì)，APX活性呈先增后降再增趨勢(shì)。高溫脅迫至8 d時(shí)，SOD、CAT活性顯著低于對(duì)照，APX活性與對(duì)照差異不顯著，POD活性顯著高于對(duì)照。在高溫脅迫下噴施外源Spd顯著提升了生菜葉片SOD活性、CAT活性和APX活性，與未噴施外源Spd相比，噴施外源Spd使生菜葉片中SOD活性、CAT活性和APX活性分別最大提升了28.6%、19.0%和42.4%，提升了SOD、CAT、APX對(duì)活性氧的清除能力。同時(shí)，噴施外源Spd還顯著降低了POD 活性，與高溫處理相比POD活性降低了21.0%。以上結(jié)果可知，高溫脅迫下，噴施外源Spd提升了SOD、CAT、APX活性，降低了POD活性。

3 討 論

高溫脅迫是植物主要非生物脅迫之一，嚴(yán)重影響著作物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量[3]。蔬菜作物在芽苗期、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期等時(shí)間遇高溫，其地下與地上部分的生長(zhǎng)發(fā)育均會(huì)受到不同程度的影響[2，4]。白菜在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期遇高溫脅迫生長(zhǎng)緩慢、葉片變黃[4]。在高溫脅迫下，生姜葉片呈現(xiàn)出明顯的水分虧缺狀及葉綠素降解[11]，豇豆幼苗生長(zhǎng)受到明顯的抑制，鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等生理指標(biāo)顯著降低[12]。本試驗(yàn)中，高溫環(huán)境使生菜幼苗植株長(zhǎng)勢(shì)明顯減弱，且葉片較為褶皺，舒展度較差，生菜鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量均顯著低于對(duì)照組植株。而高溫脅迫下外源噴施Spd有效恢復(fù)了生菜植株長(zhǎng)勢(shì)，其鮮質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量均被顯著提高。外源噴施Spd能夠顯著提升生菜的生長(zhǎng)品質(zhì)，緩解高溫脅迫對(duì)生菜苗期生長(zhǎng)造成的傷害。

圖2 外源亞精胺對(duì)高溫脅迫下生菜幼苗的抗氧化酶活性的影響

高溫脅迫下葉綠素的含量與以往研究中顯著下降的趨勢(shì)不同，本試驗(yàn)中高溫脅迫下生菜幼苗葉片中葉綠素含量顯著上升。通常認(rèn)為高溫脅迫下植物葉片中葉綠素含量下降與葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞，光合色素被降解有關(guān)[7,11,18]。而有研究表明中度和重度干旱的夏蠟梅幼苗由于相對(duì)含水量的迅速下降會(huì)導(dǎo)致葉綠素濃度上升，在脅迫中期出現(xiàn)葉綠素含量顯著上升的現(xiàn)象[18]。本試驗(yàn)表明，脅迫至8 d時(shí)，植株含水量顯著降低，高溫脅迫間接誘導(dǎo)生菜植株中的水分虧缺，由此引發(fā)葉片含水量的迅速下降，最終導(dǎo)致葉綠素含量的顯著升高。

當(dāng)植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)，植物細(xì)胞產(chǎn)生自由基與清除自由基的對(duì)立統(tǒng)一平衡會(huì)遭到破壞，自由基累積從而導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，最終使膜差別透性遭到破壞，抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育[19]。丙二醛是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性[20]。本試驗(yàn)中高溫脅迫使生菜葉片中丙二醛含量顯著增加，對(duì)植物產(chǎn)生毒害。試驗(yàn)結(jié)果表明在外源噴施Spd后的第6天起，生菜葉片中的丙二醛含量開(kāi)始逐漸大幅度減少，說(shuō)明外源噴施Spd能夠抑制膜脂過(guò)氧化，減少丙二醛的生成，從而緩解高溫對(duì)植物體的傷害。

植物體中，抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)對(duì)防御膜脂過(guò)氧化起重要作用。他們和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)等抗氧化酶構(gòu)成了能有效清除自由基的循環(huán)系統(tǒng)即ASA-GSH循環(huán)[9]。APX是植物AsA-GSH氧化還原途徑中的重要酶組分，APX利用H2O2和AsA生成脫氫抗壞血酸和H2O[24]。本研究中，在高溫處理的同時(shí)對(duì)葉面噴施1 mmol·L-1外源Spd會(huì)顯著提高APX活性，從而提升生菜植株對(duì)H2O2的清除能力，來(lái)減少植株在高溫環(huán)境下受到的傷害。

綜上所述，本研究表明在高溫環(huán)境中對(duì)生菜噴施外源亞精胺，可通過(guò)調(diào)控過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶的活性升高及調(diào)控過(guò)氧化物酶的活性降低來(lái)削弱膜脂過(guò)氧化，減少高溫脅迫對(duì)生菜造成的傷害，進(jìn)而提高其耐熱性。