中藥活性成分阿魏酸抗血小板活性和抗血栓作用的研究*

★ 劉海云 林倩霞 紀(jì)玉龍 支雪萍 李會(huì)麗 陳愛社 侯本超（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 南昌 330029）

血栓性疾病的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，當(dāng)血管內(nèi)皮損傷，繼而血小板數(shù)量增加，人體凝血活性顯著增強(qiáng)而抗凝活性降低，導(dǎo)致血栓形成，其臨床病理過程還包括血栓栓塞。近年來血栓性疾病位居廣大疾病病因之首，具有高致死率和高致殘率，包括有缺血性中風(fēng)、冠心病、急性冠狀動(dòng)脈粥樣綜合征、肺栓塞、外周血管疾病等，嚴(yán)重威脅人類的生命健康［1］。在血栓以及動(dòng)脈粥樣硬化的形成過程中，血小板起著重要的作用，其中血小板活化異常是血栓形成的重要病理學(xué)基礎(chǔ)［2］。抗血小板藥物可抑制血小板活化，對上述疾病有一定療效。因此具有抗血小板活性的藥物對于防治血栓有著重要作用。

阿魏酸是桂皮酸衍生物，易溶于熱水，難溶于苯，傘形科植物，化學(xué)名稱為4-羥基3-甲氧基肉桂酸。阿魏酸熔點(diǎn)為174 ℃，性質(zhì)穩(wěn)定，順式為黃色油狀物，反式為纖維狀結(jié)晶，合成方法簡單快速［3］。阿魏酸也是一種功能性酚酸，具有強(qiáng)大的抗氧化活性，存在于植物細(xì)胞壁中，也可使人體產(chǎn)生自由基的酶受到抑制同時(shí)清除自由基的酶增加，起到未病先防的作用。因此阿魏酸多領(lǐng)域有著多種用途。它在醫(yī)療醫(yī)藥、美容醫(yī)學(xué)、化妝品護(hù)膚品原料等有著獨(dú)特的作用，主要由于其對皮膚結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，主要作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，纖維母細(xì)胞，膠原蛋白，彈性蛋白。它抑制黑色素生成，增強(qiáng)表皮抵抗力，增強(qiáng)血管生成，增強(qiáng)新陳代謝并加速傷口愈合。作為光保護(hù)劑，延緩皮膚光敏感過程和皮膚老化而廣泛用于護(hù)理類制劑中。它不僅存在于粗糧、堅(jiān)果、干果、綠葉蔬菜等食物中，更廣泛存在于多種中藥中如：活血化瘀的當(dāng)歸、川芎，清熱的木賊、升麻、梓白皮，寧心安神的酸棗仁等［4-5］。

藥理研究和臨床應(yīng)用表明，阿魏酸鈉具有保護(hù)心血管和拮抗內(nèi)皮素生成等功效，以及還具有抑制炎性介質(zhì)生成、抗血栓形成等作用，具有廣闊的挖掘潛力。阿魏酸毒性低，具有多種生理功能（抗炎，抗腫瘤，抗氧化，抗老化，抗微生物活性和抗糖尿病作用）。血液流速減慢，粘稠度升高，血小板聚集和血栓形成是導(dǎo)致出血性和缺血壞死性疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。心腦血管疾病與血小板活性、凝血因子活性、血液粘稠度和血栓形成密切相關(guān)，為此本文研究阿魏酸抗血小板聚集、抗凝血及抗血栓形成作用，并闡明其作用機(jī)理。阿魏酸有順式和反式兩種結(jié)構(gòu)，雖然一些文獻(xiàn)表明阿魏酸抗血栓有一定作用但并未說明是哪種結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。本文從研究阿魏酸反式結(jié)構(gòu)著手進(jìn)一步研究其是否具有抗血小板活性及抗血栓的作用，從而來明確抗血栓的結(jié)構(gòu)類型，為其在心血管類疾病治療方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 購入昆明種小鼠（雌雄各半）40 只，體重在18～22 g 范圍內(nèi)；SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量300～350 g；由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號SYXK（贛）2015-0026。將小鼠置于室溫20 ℃～22 ℃，空氣濕潤新鮮，采光和通風(fēng)良好的環(huán)境中培養(yǎng)。均以固體飼料喂養(yǎng)，雌雄分籠放置，可自由活動(dòng)飲水。預(yù)培養(yǎng)1 周左右，每日觀察大小鼠的精神狀態(tài)，正式開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑 阿魏酸（浙江銀和藥業(yè)有限公司）；凝血酶時(shí)間（TT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）試劑盒均為上海太陽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號分別是20120116，20120316，20121117，20120124；阿 司 匹 林 購自 于Sigma 公 司（50 Fmol/L）；Fura-2（購 自 于Sigma 公司），其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。烏拉坦（上海展云化工有限公司，批號：120314）；阿司匹林腸溶片（沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司，批號：20065051），二磷酸腺苷adeno-sine diphosphate，ADP，上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司）

1.3 儀器 微量進(jìn)樣器（德國eppendorf 公司），恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），AdventurerTM 電子天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司），TGL-16G 型臺(tái)式高速離心機(jī)（上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠），TECAN 酶標(biāo)儀sunrise（奧地利TECAN 公司），SYSMEXCA-1500 血凝儀（SYSMEX公司）；TYXN-91 智能血液凝聚儀（上海通用機(jī)電技術(shù)研究部）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥 SD 大鼠50 只，隨機(jī)分為5組，每組10 只。組一命名為空白對照組（給予等量生理鹽水）、組二命名為陽性對照組 （給予阿司匹林30 mg·kg-1）、組三命名為阿魏酸低劑量組（給予7.5 mg·kg-1）、組四命名為中劑量組（給予15 mg·kg-1）、組五命名為高劑量組（30 mg·kg-1）。各組動(dòng)物均灌胃給藥，連續(xù)7 d；小鼠50 只，隨機(jī)分為5 組 ，每組10 只，按大鼠的分組方法和劑量給藥7 d。阿魏酸的劑量設(shè)置參照文獻(xiàn)［6］。

2.2 中藥阿魏酸對大鼠凝血功能的影響［7］末次給藥2 h 后腹腔注射20 %氨基甲酸乙酯1 mL/Kg，麻醉大鼠，按照無菌操作，腹主動(dòng)脈采血，采用3.8%檸檬酸鈉抗凝，血液與抗凝劑之比為9∶1，然后以2500 r·min-1離心10 min，取血漿。按試劑盒說明測定TT、PT 和APTT。

2.3 對小鼠凝血時(shí)間的影響［8］本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)玻璃管法測定全血凝血時(shí)間。每組大鼠小鼠按照“2.2”中分組方法與劑量給藥7 d，記錄每次給藥時(shí)間。于末次給藥后2 h 用直徑1 mm 的玻璃毛細(xì)管插入小鼠眼底靜脈叢取血，血液迅速流入毛細(xì)玻璃管，當(dāng)毛細(xì)管血液被注滿后使其平放于桌上，開始計(jì)時(shí)，每隔20 s 折斷兩兩端毛細(xì)玻璃管，并緩慢向左右拉開，直至出現(xiàn)血凝絲停止計(jì)時(shí)，所得時(shí)間即為小鼠凝血時(shí)間（CT）。

2.4 對大鼠動(dòng)一靜脈血流旁路血栓形成的影響［9］按照“2.2”中的動(dòng)物分組、方法與劑量規(guī)律給藥7 d。末次給藥2 h 后，腹腔注射20%氨基甲酸乙酯1 mL/Kg，麻醉大鼠，嚴(yán)格按照無菌操作，將大鼠固定于手術(shù)架，頸部剪毛，消毒，鋪巾，提捏頸部，在正中剪3 cm 切口，逐層分離，充分暴露出右頸總動(dòng)脈和左頸外靜脈，動(dòng)作輕柔避免牽拉，然后取一根由三段聚乙烯管組成的套管，水平放置，在管中段放一根6 cm 長度的精密質(zhì)量的4 號手術(shù)絲線，注入肝素生理鹽水溶液（50 u·mL）充滿聚乙烯管，輕柔穩(wěn)定插進(jìn)分離出的右頸總動(dòng)脈和左頸外靜脈，防止溶液溢出，動(dòng)-靜脈血流旁路開放15 min 后中斷血流，迅速取出絲線稱質(zhì)量，總質(zhì)量減去絲線質(zhì)量即得血栓濕重，60 ℃干燥30 min，稱量干重，并計(jì)算血栓抑制率。

抑制率=（空白組血栓質(zhì)量-給藥組血栓質(zhì)量）/空白組血栓質(zhì)量×100 %

2.5 統(tǒng)計(jì)處理 用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 17.0 對各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示，用LSD 法行組間兩兩分析并進(jìn)行比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 阿魏酸對大鼠凝血功能的影響 與正常對照組比較，阿魏酸小劑量組對延長TT、PT、APTT 的作用不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；阿魏酸中、大劑量組和阿司匹林顯著延長TT、PT、APTT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表1。

表1 阿魏酸對大鼠凝血功能的影響（，n=10）組別 劑量/mg.kg-1 PT/s TT/s APTT/s正常對照組（生理鹽水） - 14.12±0.51 18.43±0.15 29.12±0.25阿司匹林組 30 23.14±0.321） 30.12±0.331） 42.62±0.321）低劑量給藥組 7.5 15.19±0.32 19.24±0.14 31.43±0.672）中劑量給藥組 15 21.09±0.242） 25.21±0.281） 35.51±0.251）高劑量給藥組 30 28.32±0.121） 41.34±0.341） 24.11±0.621）注：與生理鹽水組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。

3.2 對小鼠凝血時(shí)間的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組中阿魏酸低劑量組CT 延長不明顯，而阿魏酸中、高劑量組和陽性對照組（阿司匹林）CT 明顯延長（P＜0.05、P＜0.01），其延長率分別為28.9 %、46.7 %，見表2。

3.3 對大鼠動(dòng)一靜脈旁路血栓形成的影響 結(jié)果表明，與正常對照組比較，阿魏酸低、中、高劑量組和阿司匹林組均明顯減輕血栓濕重（P＜0.01，P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。阿魏酸低、中、高劑量組對大鼠動(dòng)一靜脈旁路血栓抑制率分別為14.28 %，20.69 %和32.65 %（P＜0.05），見表3。

表2 對小鼠凝血時(shí)間（CT）的影響（，n=10）組別 劑量/mg.kg-1 CT/s 延長率/%正常對照組（生理鹽水） - 300.42±43.15 -阿司匹林組 30 510.04±68.621） 60.5低劑量給藥組 7.5 332.25±48.242） 8.4中劑量給藥組 15 350.09±51.431） 28.9高劑量給藥組 30 406.18±58.161） 46.7注：與正常對照組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。

表3 對大鼠動(dòng)一靜脈旁路血栓形成的影響（，n=10）組別 劑量/mg.kg-1 濕重/mg 干重/mg 抑制率/%正常對照組（生理鹽水） - 40.42±1.15 18.26±0.64 -阿司匹林組 30 21.32±1.261） 11.32±0.621） 37.23低劑量給藥組 7.5 36.69±2.122） 16.42±1.23 14.28中劑量給藥組 15 30.09±2.421） 14.21±1.382） 20.69高劑量給藥組 30 23.76±3.821） 12.78±1.221） 32.65注：與生理鹽水組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。

4 討論

隨著生活水平的提高，心血管疾病的發(fā)病率也逐年增加，血栓性疾病占心血管疾病的比例很高。據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國血栓性疾病患者超過1 千萬，發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他疾病，且有逐年遞增的趨勢［1］，其中血小板功能異常導(dǎo)致的血栓疾病是心血管疾病發(fā)病的主要原因［10］。抗血栓的西藥存在很大的副作用，所以選用副作用小又有效的中藥是切實(shí)可行的方法，對臨床防治抗血栓形成具有重要意義。

血栓的形成與血小板的聚集、黏附及釋放反應(yīng)有關(guān)。血液凝固包括內(nèi)源性凝血和外源性凝血兩種途徑。內(nèi)源性凝血是由十二凝血因子啟動(dòng)的，通過激活血小板的膜表面磷脂。外源性凝血是組織損傷由血管外的組織因子釋放入血而啟動(dòng)的凝血過程。凝血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間可以反映內(nèi)外源性凝血的功能狀況［11］。

凝血功能指標(biāo)PT、TT、APTT 在一定程度上能夠反映機(jī)體凝血系統(tǒng)的狀態(tài)，APTT 和TT 可以反映內(nèi)源性凝血的功能狀態(tài)，PT 是反映外源性凝血途徑的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿魏酸明顯延長了大鼠血漿中PT、TT、APTT，說明阿魏酸能抑制內(nèi)、外源性凝血，從而抑制凝血酶的活性達(dá)到抗血栓的作用。

小鼠出血時(shí)間主要反映血小板的功能。出血時(shí)間的長短與血小板的數(shù)量和功能、毛細(xì)血管功能、凝血因子及纖溶等因素有關(guān)，毛細(xì)血管功能和血小板對其的影響最大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿魏酸明顯延長小鼠的出血時(shí)間，其原因可能是通過抑制血小板活性實(shí)現(xiàn)的。

血管內(nèi)皮破壞、血小板功能異常以及血流改變與淤積是血栓形成的三個(gè)因素［12］。而血小板粘附聚集是血栓形成過程中很重要的一步，通過阻斷血小板活化或抑制與其它配體結(jié)合可以影響血小板粘附聚集［13］。血小板的黏附性是血小板與粗糙物接觸，黏附于其表面，是一項(xiàng)重要的止血功能。血小板黏附率越高，聚集性越強(qiáng)，血液粘稠度增高，易形成血栓。動(dòng)靜脈旁路血栓模型的建立是用于測量整體血流中血液速度、血液粘稠度及血小板的吸附能力和聚集的影響［14］。血小板功能的異常是血栓結(jié)構(gòu)能夠形成的直接原因，該血栓模型類似動(dòng)脈中的白色血栓，比較接近人體的生理與病理狀態(tài)［15］。動(dòng)脈血流中的普遍廣泛存在的血小板一旦接觸粗糙物表面，血小板的粘附性立馬表現(xiàn)出來，隨著動(dòng)脈血流動(dòng)，血液粘稠度迅速升高，血液中累積的血小板聚集環(huán)繞在粗糙物表面而快速形成血小板血栓。形成的血栓濕重越小，對應(yīng)的血栓形成抑制率就越大。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中藥各組及陽性對照組均可減輕動(dòng)靜脈旁路形成的血栓干濕重，證明中藥阿魏酸對血栓形成具有一定的抑制率。

綜上所述，中藥活性成分阿魏酸可以延長小鼠凝血時(shí)間，中高劑量組明顯延長大鼠PT、APTT、TT， 中藥各劑量組明顯減輕動(dòng)靜脈旁路血栓干重和濕重，明顯增加了血栓抑制率，從而達(dá)到抗血栓的作用。由此表明，阿魏酸具有顯著抗血栓的功效，其抗血栓的作用可能與改善凝血功能、血小板聚集黏附功能有關(guān)。