孫麗莉, 張朝, 陳剛, 彭曉萌, 謝映松, 胡立中, 葛少林

光譜法研究高效氯氰菊酯與牛血清白蛋白的相互作用

孫麗莉, 張朝, 陳剛, 彭曉萌, 謝映松, 胡立中, 葛少林

(煙草化學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 安徽 合肥, 230088)

在模擬生理?xiàng)l件下, 應(yīng)用光譜法研究煙草農(nóng)藥殘留與蛋白質(zhì)相互作用機(jī)理, 為煙草中農(nóng)藥殘留在人體中代謝過程、解毒和指導(dǎo)科學(xué)使用農(nóng)藥提供理論依據(jù)。結(jié)果表明: 高效氯氰菊酯與牛血清白蛋白作用機(jī)理為靜態(tài)猝滅; 兩者通過氫鍵和范德華力形成1︰1結(jié)合, 且結(jié)合距離為3.95 nm; 298和310 K時(shí)的結(jié)合常數(shù)分別為4.17 × 103和3.16 × 103L·mol-1, 結(jié)合強(qiáng)度緊密; 同步熒光和圓二色譜證實(shí)高效氯氰菊酯影響牛血清白蛋白構(gòu)象, 使BSA分子-螺旋結(jié)構(gòu)含量減小。

熒光光譜; 圓二色譜; 同步熒光; 高效氯氰菊酯; 牛血清白蛋白

煙葉種植生產(chǎn)中, 由于安全意識(shí)淡薄, 農(nóng)藥時(shí)有被過量使用, 導(dǎo)致農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)增加。殘留的農(nóng)藥可通過空氣、食物鏈等被人體吸收, 與人體中蛋白質(zhì)反應(yīng)引起急性中毒, 嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡[1]。目前, 煙葉中農(nóng)藥殘留檢測和降解方法研究較多, 對農(nóng)藥在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和中毒機(jī)制研究較少, 因此農(nóng)藥與生物體蛋白質(zhì)的機(jī)理研究是目前的研究重點(diǎn)。高效氯氰菊酯(β-CP, 結(jié)構(gòu)見圖1)是一種殺蟲廣譜、生物活性高、高效低毒擬除蟲菊酯類殺蟲劑[2], 被廣泛用于防治煙葉植物害蟲。牛血清白蛋白(BSA)是血漿中含量最豐富的載體蛋白, 常被用作蛋白質(zhì)模型[3]。本文在模擬生理?xiàng)l件下, 運(yùn)用光譜法研究牛血清白蛋白和高效氯氰菊酯的作用機(jī)理, 以期從分子角度分析研判β-CP在生物體內(nèi)的活性機(jī)制, 為研制低毒高效煙草農(nóng)藥、解毒方法和安全使用農(nóng)藥提供理論參考。

圖1 高效氯氰菊酯結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

高效氯氰菊酯(純度98%, 阿拉丁); 牛血清白蛋白(純度>98%, 阿拉丁); NaCl(分析純, 國藥集團(tuán)試劑公司); pH = 7.4 Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液; 無水乙醇(安徽安特生物化學(xué)有限公司); 二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

F-4500 熒光分光光度計(jì)(日立公司); UV-757CRT紫外可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司); Jasco-20c圓二色譜儀(日本島津公司)。KQ-500DE超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司); AL-204-IC電子天平(感量0.000 1 g, 瑞士Mettler Toledo公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熒光光譜分析

用移液管準(zhǔn)確移取1 mL BSA溶液(1.0×10-5mol/L)、1 mL Clark-lubs緩沖溶液(pH 7.40)、1 mL NaCl溶液(0.1 mol/L)于10 mL比色管中, β-CP溶液(1.0×10-4mol/L)依次取0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL, 用二次蒸餾水定容到10 mL, 分別在298和310 K溫度下水浴反應(yīng)15 min, 立即進(jìn)行熒光測定。

熒光光譜: 在280 nm激發(fā)波長下, 掃描溶液300～500 nm的熒光發(fā)射光譜。調(diào)狹縫寬5 nm, 光電管負(fù)高壓為400 V, 響應(yīng)速度2.0 s, 掃描速度1 200 nm/min。

1.3.2 同步熒光

固定發(fā)射波長與激發(fā)波長差Δλ分別為60 nm和15 nm, 調(diào)節(jié)儀器參數(shù): 波長范圍240～360 nm, 光電管負(fù)高壓400 V, 狹縫寬度5 nm, 掃描速度1 200 nm/min。

1.3.3 圓二色譜分析

將待測液置于1 mm石英吸收池中, 步幅1 nm, 掃描速度200 nm·min-1, 掃描250～350 nm范圍內(nèi)BSA與β-CP作用前后的CD光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-CP與BSA相互作用熒光光譜

BSA的內(nèi)源熒光由色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三種熒光團(tuán)組成, 但BSA 的熒光強(qiáng)度主要來源于色氨酸殘基[4]。β-CP與BSA相互作用發(fā)生的熒光變化見圖2。隨著β-CP濃度的逐漸增加, BSA的最大發(fā)射峰由352 nm藍(lán)移到344 nm, 最大熒光強(qiáng)度也規(guī)律性減小, 表明β-CP和BSA發(fā)生相互作用, BSA內(nèi)源熒光被猝滅。

圖2 β-CP與BSA相互作用熒光光譜

2.2 β-CP對BSA熒光猝滅機(jī)理

2.2.1 β-CP-BSA的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)(SV)

β-CP對BSA的內(nèi)源熒光猝滅有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[5], 為明確β-CP對BSA的猝滅類型, 研究298和310 K溫度下β-CP-BSA反應(yīng)體系。假設(shè)體系是動(dòng)態(tài)猝滅, 遵循Stern-Volmer[6]方程:0/=1+SV[]=1+q0,0為體系的原始熒光強(qiáng)度,為β-CP-BSA作用后的熒光強(qiáng)度; []是β-CP的摩爾濃度;SV是體系的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù);q為猝滅速率常數(shù);τ是BSA的熒光壽命(一般取生物大分子熒光壽命的平均值10-8s[4])。圖3是298和310 K下, 由Stern-Volmer方程作出的β-CP對BSA的猝滅圖,sv和q值見表1。

圖3 β-CP與BSA相互作用的Stern-Volme曲線

若β-CP-BSA體系為動(dòng)態(tài)猝滅, 則動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)隨溫度的升高而不斷增大[7]。但由表1數(shù)據(jù)可知sv隨溫度的升高反而降低, 且298 K和310 K時(shí)的q均大于猝滅劑對生物大分子最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù), 由此判斷β-CP-BSA體系不屬于動(dòng)態(tài)猝滅, 該體系為靜態(tài)猝滅, 即β-CP與BSA作用生成不發(fā)熒光的復(fù)合物, 導(dǎo)致BSA熒光猝滅[7]。

表1 不同溫度下β-CP與BSA的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)

2.2.2 靜態(tài)結(jié)合常數(shù)(A)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)()

β-CP與BSA發(fā)生靜態(tài)猝滅作用時(shí)可能存在個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)[5], 根據(jù)公式[8]lg(0-)/= lgA+lg[Q], 由lg(0-)/～lg[Q]作圖, 斜率為兩者結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(), 截距為二者的表觀結(jié)合常數(shù)A[5], 結(jié)果見表2。

由表2可知, 體系的結(jié)合常數(shù)達(dá)到103L·mol-1以上, 說明兩者結(jié)合較強(qiáng); 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)近似為1, 說明一個(gè)BSA分子有一個(gè)β-CP結(jié)合位點(diǎn); β-CP-BSA的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而減小, 說明該過程是靜態(tài)猝滅過程, 反應(yīng)生成的復(fù)合物受溫度影響較大, 溫度升高復(fù)合物穩(wěn)定性降低[5]。

2.2.3 作用力類型

β-CP與BSA之間的作用力有氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水力等[4]。根據(jù)Van’t-Hoff方程[9]ln=-Δ/+ Δ/Δ= Δ-Δ[10], 以ln對1作圖, 由斜率-Δ/和截距Δ/求得Δ和Δ, 得到β-CP-BSA的熱力學(xué)參數(shù)。根據(jù)前人的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)得出: Δ和Δ均大于0時(shí)的作用力為疏水作用, ΔΔ均小于0時(shí)的作用力為氫鍵和范德華力, 當(dāng)Δ<0, Δ>0, 作用力為靜電引力[11]。298 K和310 K下, β-CP與BSA體系的熱力學(xué)參數(shù)見表3。

表3中ΔG、Δ、Δ均小于0, 表明β-CP- BSA體系是一個(gè)自發(fā)的放熱過程, 作用力主要是氫鍵和范德華力; 溫度升高時(shí), β-CP-BSA復(fù)合物的穩(wěn)定性減弱, 復(fù)合物可能發(fā)生分解, 導(dǎo)致β-CP-BSA的結(jié)合常數(shù)減小[5], 更進(jìn)一步證實(shí)β-CP對BSA為靜態(tài)猝滅。

2.2.4 結(jié)合距離

為β-CP︰BSA = 1︰1時(shí)的復(fù)合物熒光強(qiáng)度,是熒光光譜(BSA)與吸收光譜(β-CP)的重疊積分,為熒光量子產(chǎn)率(BSA),()為BSA在波數(shù)為時(shí)的熒光強(qiáng)度,ε()為β-CP在波數(shù)為時(shí)的摩爾吸光系數(shù)[5]。對于BSA, 取向因子取給體受體各向隨機(jī)分布的平均值2= 2/3, 量子產(chǎn)率= 015,折射指數(shù)取水和有機(jī)物平均值= 1.336[5]。

根據(jù)公式計(jì)算得出β-CP與BSA的結(jié)合距離()為3.95 nm, 結(jié)合距離小于7 nm, 符合F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移條件, BSA的能量通過形成復(fù)合物轉(zhuǎn)移給β-CP, 再一次驗(yàn)證β-CP對BSA為靜態(tài)猝滅。

2.3 β-CP對BSA構(gòu)象的影響

2.3.1 同步熒光

β-CP可以猝滅BSA的內(nèi)源熒光, 推測BSA的構(gòu)象可能發(fā)生變化。酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸是BSA主要的熒光發(fā)色團(tuán), 但色氨酸對微環(huán)境的變化最敏感[4]。Δ= 15 nm主要提供酪氨酸殘基的微環(huán)境變化信息, Δ= 60 nm主要提供色氨酸殘基的微環(huán)境變化信息[13], 如圖5中(a)和(b)。

圖4 β-CP吸收光譜(a)與BSA熒光光譜(b)的重疊光譜

圖5 Δλ=15 nm(a)和60 nm(b)的同步熒光光譜

由圖4(a)和(b)可知, β-CP對BSA中酪氨酸殘基和色氨酸殘基均有猝滅作用, 且熒光強(qiáng)度均隨β-CP濃度的增加而降低, 但色氨酸殘基(Δ= 60 nm)最大發(fā)射峰明顯藍(lán)移, 酪氨酸殘基(Δ= 15 nm)最大熒光峰未發(fā)生明顯位移, 說明色氨酸殘基微環(huán)境發(fā)生變化, 色氨酸殘基對環(huán)境變化更敏感, 由此推斷β-CP對BSA的熒光猝滅, 主要是BSA分子中色氨酸殘基的熒光猝滅, 色氨酸殘基所處微環(huán)境的疏水性增強(qiáng), β-CP與BSA可能在疏水空腔內(nèi)結(jié)合, BSA的疏水腔結(jié)構(gòu)被打開, 增加肽鏈的伸展程度。

2.3.2 圓二色譜

β-CP對BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響還可以應(yīng)用CD法研究。圖6是β-CP加入前、后BSA的CD譜圖。由圖6(1)可知, BSA在209 nm和218 nm處有兩處負(fù)的吸收峰, 加入β-CP后(圖6(2))BSA兩個(gè)負(fù)峰向低波數(shù)移動(dòng), 吸收強(qiáng)度也減弱, 說明β-CP使BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性減弱。根據(jù)公式:% = [(-[θ]208-4 000)/(33 000-4 000)] × 100%[14], 計(jì)算得出BSA的-螺旋結(jié)構(gòu)含量由31.37%減小到29.22%, 表明β-CP改變BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu), β-CP通過氫鍵和范德華力與BSA分子的肽鍵形成配位鍵, 使BSA分子肽鏈伸展。

圖6 BSA和β-CP-BSA的圓二色譜

3 結(jié)論

通過熒光光譜研究得知β-CP與BSA的猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅, 該反應(yīng)是一個(gè)自發(fā)過程; β-CP主要通過氫鍵和范德華力與BSA分子形成1︰1的較強(qiáng)結(jié)合, 結(jié)合常數(shù)達(dá)到103L·mol-1以上, 結(jié)合距離是3.95 nm。同步熒光和CD的研究結(jié)果表明β-CP使BSA分子中色氨酸殘基的疏水性增強(qiáng), BSA分子的-螺旋結(jié)構(gòu)含量由31.37%減小到29.22%, 證實(shí)β-CP影響B(tài)SA的構(gòu)象。

本文詳細(xì)闡述了煙草中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥β-CP殘留被人體吸收后, 與體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用機(jī)理, 這對揭示殘留農(nóng)藥在人體內(nèi)代謝過程、解毒和安全科學(xué)使用農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

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Spectrctroscopic studies on the interaction between beta cypermethrin residue in tobacco and bovine serum albumin

Sun Lili, Zhang Zhao, Chen Gang, Peng Xiaomeng, Xie Yingsong, Hu Lizhong, Ge Shaolin

(Anhui Key Laboratory of Tobacco Chemistry, Hefei 230088, China)

The interaction between Beta cypermethrin and BSA is studied by spectroscopic methods in orde toprovide theoretical reference for the transport, metabolism and poisoning mechanism of residual pesticides in tobacco leaves, and provide guidance for the scientific and effective use of pesticides under simulative physiological conditions. The results show that fluorescence quenching mechanism of Beta Cypermethrin with BSA is a static quenching procedure, the interaction are mainly the hydrogen bond and Van der Waals force; The distance between them was 3.95 nm by F?rster non-radiative energy transfer theory and the apparent binding constants (A) are 4.168×103(298 K) and 3.162×103(310 K) L·mol-1, and the binding sites () is 1; The results of CD spectra and the synchronous fluorescence indicate that the secondary structure of BSA is changed when beta cypermethrin is bound to BSA, and the content of-helical structure decreases.

fluorescence spectroscopy; CD spectroscopy; synchronous fluorescence; Beta cypermethrin; BSA

O 657.39

A

1672–6146(2020)04–0032–05

10.3969/j.issn.1672–6146.2020.04.006

孫麗莉, 18756997517@126.com; 葛少林, 236897248@qq.com。

2019–11–18

煙草化學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2017137)。

(責(zé)任編校: 郭冬生)