翻譯起始因子 eIF3A 調(diào)控喉癌順鉑敏感性的試驗(yàn)研究

郭龍梅，徐雪媚，蔡勛功，趙 東，周 彬

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 耳鼻咽喉科，黑龍江 哈爾濱150001)

順鉑是喉癌化療中的常用藥物，然而眾多的患者存在耐藥現(xiàn)象，尋找藥物敏感性的分子標(biāo)志物對(duì)臨床治療具有重要意義[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)翻譯起始因子 eIF3A 可能與頭頸部腫瘤細(xì)胞的順鉑敏感性有關(guān)[2]，在本研究中我們驗(yàn)證其對(duì)喉癌細(xì)胞順鉑敏感性的調(diào)節(jié)作用，探討其作為順鉑敏感性分子標(biāo)志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

BPN紅外CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(成都泰盟科技有限公司)、721型分光光度計(jì)(成都泰盟科技有限公司)、ABI 3900臺(tái)式DNA合成儀(美國(guó)應(yīng)用生物科技公司)、ABI 9700 PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物科技公司)、ABI 7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物科技公司)、光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)等。

1.2 主要試劑及藥品

順鉑(齊魯制藥有限公司；批號(hào)：040806)、MTT(sigma公司)、DMSO(sigma公司)、DEPC(南京建成生物工程研究所)、Trizol(南京碧云天生物科技公司)、dNTPs(南京碧云天生物科技公司)、MMLV(南京碧云天生物科技公司)、Taq酶(北京奧科生物科技公司)、TUNEL原位末端標(biāo)記檢測(cè)試劑盒等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞的分組及處理 喉癌Hep-2細(xì)胞分為處理組及對(duì)照組，處理組細(xì)胞過表達(dá)eFI3A，處理方法如下：(1)克隆eIF3A CDs區(qū)克隆到慢病毒載體pLVSIN CMV Puro上。(2)將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞獲得過表達(dá)eFI3A的慢病毒以及對(duì)照空病毒。(3)利用制備好的慢病毒感染Hep-2細(xì)胞24 h后換液，感染48 h后添加適量嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)eFI3A Hep-2細(xì)胞以及對(duì)照Hep-2細(xì)胞的篩選。篩選48 h后獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株利用含嘌呤霉素(篩選濃度的一半劑量)維持培養(yǎng)[3]。

1.3.2細(xì)胞的培養(yǎng)及干預(yù) 對(duì)兩組Hep-2細(xì)胞進(jìn)行同條件培養(yǎng)，采用1640培養(yǎng)液，其中加入胎牛血清、青霉素、鏈霉素。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，去除死細(xì)胞。細(xì)胞傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后采用同等量的順鉑溶液對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，順鉑濃度為40 mg/L[4]。

1.3.3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率檢測(cè) 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)抑制率檢測(cè)，配備成5×104/ml的懸浮液后接種到96孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后清洗換液，加入培養(yǎng)基及處理液，使其濃度梯度為10、20、40、80及160 mg/L。再次培養(yǎng)24及48 h吸干孔中原液后加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸取原液并于每個(gè)孔中加入二甲基礬，混勻后使用自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)量a值。抑制率(fa)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/空白組平均A值)×100%[5]。

1.3.4細(xì)胞總RNA提取 培養(yǎng)5天后從無菌室取出各組細(xì)胞并棄掉上清液，按相關(guān)流程依次加入Trizol、氯仿并孵育及離心，加入異丙醇離心后再經(jīng)乙醇處理，再次離心去掉上清液得到白色沉淀，真空干燥后通過DEPC處理過的水溶解RNA，最后加入2.5倍體積的75%的乙醇溶液，在-80℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆肹6]。

1.3.5mRNA引物合成

在 GenBank上查找目的基因mRNA序列，特異性引物采用 Primer express2.0軟件進(jìn)行跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)，引物的合成使用的儀器是ABI3900臺(tái)式DNA合成儀[7]，序列如下：Survivin序列(擴(kuò)增片段 AACAGCGACACCCACTCCTCCACC，長(zhǎng)度129 bp),Forward primer：5′-AAC ACT GCT GCT GTG GAC CCT ACT-3′;Reverse primer：5′-GAC AAC TGC GTC TCTG-3′。Caspase3序列(擴(kuò)增片段，長(zhǎng)度101 bp)，F(xiàn)orward Primer：5′-AGT GGA GGC CGA CTT CCT GTA-3′;Reverse primer 5′-TGG CGC AAA GTG ACT GGA T-3′。

1.3.6實(shí)時(shí)定量檢測(cè) 將上述提取的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用反向緩沖液、下游引物、DNPS、MMLV、DEPC等作為反應(yīng)體系。進(jìn)行定量PCR并依次使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法、凝膠電泳法，通過測(cè)量OD260確定陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)并建立標(biāo)準(zhǔn)品梯度。在含有SYBR Green I PCR緩沖液、Taq酶、cDNA、ddH2O、dNTP、上游引物f及下游引物R的反應(yīng)體系中對(duì)樣品及陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR反應(yīng)，在各相應(yīng)溫度下按相關(guān)規(guī)程共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0處理所有數(shù)據(jù)，多組符合正態(tài)分布的定量使用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P<0.05認(rèn)為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況的比較

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，處理組及對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為25.6±5.8及4.1±0.3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，處理組及對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為51.4±7.5及4.0±0.4，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 各組喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況

2.2 各組喉癌Hep-2細(xì)胞 Caspase3 mRNA及Survivin mRNA的表達(dá)情況

細(xì)胞培養(yǎng)5天后，處理組及對(duì)照組細(xì)胞 Caspase3 mRNA表達(dá)水平分別為1.93±0.27及0.84±0.14，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；處理組及對(duì)照組細(xì)胞 Survivin mRNA表達(dá)水平分別為0.52±0.14及1.34±0.17，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表2。

表2 各組喉癌Hep-2細(xì)胞 Caspase3 mRNA及Survivin mRNA的表達(dá)

3 討論

喉癌是耳鼻咽喉科較常見惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，目前以手術(shù)為主的綜合療法仍是喉癌的主要治療模式[9]，化療就是其中尤為重要的輔助治療手段，而順鉑是喉癌化療中較為敏感和最為常用的藥物[10]。研究顯示在喉癌化療中無論單獨(dú)用藥或者聯(lián)合用藥、術(shù)前用藥或者是術(shù)后用藥，順鉑都表現(xiàn)出了良好的療效，然而也有眾多的喉癌患者表現(xiàn)出了對(duì)順鉑的耐藥性[11]。因此，尋找順鉑敏感性的分子標(biāo)志物，增加腫瘤組織對(duì)順鉑的敏感性，對(duì)于喉癌的治療具有重大的意義。

eIF3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最復(fù)雜的真核起始因子，其分子量為550-700 kDa，由13個(gè)亞基組成，在細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的調(diào)控中起重要作用[12]，eIF3A是eIF3中最大的亞基。eIF3A在人體正常組織中不表達(dá)或表達(dá)很低，而在乳腺癌、食管癌、宮頸癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中高表達(dá)，由此推測(cè)eIF3A可能與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[13]。已有研究表明eIF3A與鼻咽癌等頭頸部腫瘤的順鉑敏感性有關(guān)[14]，在本研究中我們檢驗(yàn)了其在喉癌順鉑化療中的作用。我們的研究結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，在eIF3A高表達(dá)的喉癌細(xì)胞株中應(yīng)用順鉑后細(xì)胞增殖明顯受到抑制，說明該類細(xì)胞株對(duì)順鉑的反應(yīng)性明顯增強(qiáng)。

Caspase3是半胱氨酸蛋白酶家族成員，又稱細(xì)胞凋亡因子，它能夠通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終效應(yīng)因子[15]。Survivin又稱為細(xì)胞增殖因子，它能夠通過多種途徑對(duì)細(xì)胞的凋亡及增殖進(jìn)行調(diào)控，來發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用，其中也包括對(duì) Caspase-3蛋白活性的抑制[16]。這兩個(gè)因子能夠調(diào)控腫瘤的活性，因此其表達(dá)的高低能夠作為評(píng)估抗腫瘤方案敏感性的指標(biāo)[17]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，處理組細(xì)胞 Caspase3 mRNA表達(dá)水平升高，Survivin mRNA表達(dá)水平降低。這說明eIF3A的高表達(dá)可能影響了Caspase-3及Survivin的活性，協(xié)同促進(jìn)了喉癌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮了增加順鉑敏感性的作用，我們會(huì)在后續(xù)的試驗(yàn)中對(duì)其機(jī)制進(jìn)行更加深入的研究。

綜上所述，eIF3A的高表達(dá)能夠明顯增加喉癌Hep-2細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，并影響了Caspase3 mRNA及Survivin mRNA的表達(dá)。相信隨著研究的不斷深入，eIF3A有望成為喉癌順鉑敏感性的重要分子標(biāo)志物，為喉癌的化療發(fā)揮重要的指導(dǎo)作用。