于 迪,龔興瑞,呂 靖,張雨飛,田書寧,魏 瓊,蒙 臣,李 清

0 引 言

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是引起全球人口死亡的第1位因素，因此治療缺血性心肌病帶來的心肌損傷尤為重要[1]。而在治療過程中，無法避免再灌注帶來的心肌損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[2-3]。托烷司瓊是目前臨床預防術(shù)后惡心、嘔吐的常用藥物，除傳統(tǒng)的止吐作用外，托烷司瓊還可通過調(diào)節(jié)α7煙堿乙酰膽堿受體(α7 nictinic acetylcholine receptor，α7nAchR)發(fā)揮抗炎療效[4]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-acyivated protein kinase，p38 MAPK)是一種與細胞增殖、分化、炎癥反應相關的重要信號通路，在MIRI中也扮演著重要角色[5]。MLA作為α7nAchR的競爭性拮抗劑，可通過抑制α7nAchR拮抗托烷司瓊達到抗炎作用，而在心肌保護的作用機制中鮮有報道[6]。為此，本研究采用H9C2心肌細胞缺氧/復氧實驗模擬心肌缺血再灌注損傷模型[7-8]，觀察托烷司瓊是否通過激活α7nAchR在p38 MAPK信號通路對H9C2心肌細胞產(chǎn)生影響，為今后缺血性心肌病及其并發(fā)癥的治療提供新的理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國)，酶標儀(上海儀濤，中國)，低溫高速離心機(Eppendorf，德國)，熒光倒置顯微鏡(Leica，德國)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，美國)。乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。TNF-α、IL-1β 的ELISA試劑盒，購自欣博盛有限公司。CCK-8細胞增殖檢測試劑盒，購自東京生物科技有限公司。托烷司瓊購自江蘇瑞恒醫(yī)藥有限公司。MLA拮抗劑、兔抗鼠Cleaved caspase-3抗體、兔抗鼠GAPDH抗體，購自Cell Signaling Technology公司，鼠抗鼠p-p38抗體，購自Sigma，兔抗鼠p-pka抗體，辣根過氧物酶標記山羊抗兔和山羊抗鼠IgG二抗，均購自abcom。

1.2細胞培養(yǎng)與模型建立用來自ATCC公司H9C2胚胎大鼠心臟源性心室細胞，將細胞放置于二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中孵育，根據(jù)細胞狀態(tài)更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞生長至80% 時，利用胰蛋白酶消化進行傳代與后續(xù)試驗；缺氧/復氧模型建立：①將H9C2心肌細胞正常培養(yǎng)24至48 h，待細胞生長至80%，棄去舊培養(yǎng)液，加入無糖無血清培養(yǎng)基；②將細胞置于缺氧罐中(5%CO2+1%O2+94%N2混合氣體)預充5 min,再將缺氧罐置于37 ℃培養(yǎng)箱環(huán)境中采取不同缺氧時間(6、12、24 h)處理；③經(jīng)缺氧處理后的細胞從缺氧罐中取出，更換成含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)6 h，結(jié)果表明，缺氧12 h可引起H9C2心肌細胞存活率的明顯下降，24 h細胞存活率過低，因此后續(xù)實驗均采用缺氧12 h復氧6 h建立模型。

1.3確定托烷司瓊的最適合濃度及細胞分組使用CCK-8法明確托烷司瓊保護作用的最適合濃度，分別在H9C2心肌細胞缺氧前加入濃度1、10、100、1000 nmol/L的托烷司瓊，托烷司瓊在10 nmol/L時，細胞活力最佳，因此選擇托烷司瓊終濃度10 nmol/L進行后續(xù)實驗。將培養(yǎng)好的H9C2心肌細胞分為正常組、溶劑對照組、缺氧/復氧組、托烷司瓊組、MLA拮抗劑組、托烷司瓊+MLA拮抗劑組6組：①正常組：不給予任何處理正常培養(yǎng)的H9C2心肌細胞；②溶劑對照組：H9C2心肌細胞加入10 nmol/L的托烷司瓊，不做缺氧/復氧處理，正常培養(yǎng)18 h。③缺氧/復氧組：將H9C2心肌細胞進行缺氧12 h，復氧6 h處理；④托烷司瓊組：H9C2心肌細胞缺氧前1h加入終濃度10 nmol/L的托烷司瓊預處理，再進行缺氧/復氧處理；⑤MLA拮抗劑組：H9C2心肌細胞缺氧前2h加入終濃度10 nmol/L 的MLA拮抗劑預處理，再進行缺氧/復氧處理；⑥托烷司瓊+MLA拮抗劑組：H9C2心肌細胞缺氧前2h加入終濃度10 nmol/L的 MLA拮抗劑，1h后給予終濃度10 nmol/L的托烷司瓊，再進行缺氧/復氧處理。

1.4CCK-8 檢測將H9C2心肌細胞消化重懸，細胞計數(shù)后，以每孔1×104個接種于96孔板，每組重復5個復孔，接種后培養(yǎng)24 h使細胞貼壁長至80%左右，按照不同分組處理后，棄去培養(yǎng)基在孔內(nèi)加入含10%CCK-8反應液的100 μL培養(yǎng)基，立即放入培養(yǎng)箱孵育。1 h后用酶標儀檢測各孔A值(450 nm波長下吸光度值)。

1.5乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗將H9C2心肌細胞消化重懸，細胞計數(shù)后，以3×105個接種于6孔板，培養(yǎng)48 h待細胞融合至80%左右，按照不同分組處理后，取細胞培養(yǎng)上清液，待嚴格按照LDH試劑盒說明操作，每組重復5個復孔，檢測細胞中LDH活性。

1.6ELISA法檢測按照上述方法不同分組處理后，取細胞培養(yǎng)上清液，待嚴格按照雙抗體夾心ELISA法檢測細胞中TNF-α、IL-1β濃度，每組重復5個復孔。

1.7細胞免疫熒光染色提前制作細胞爬片固定于12孔板培養(yǎng)皿內(nèi)，待細胞消化重懸后，接種于12孔板培養(yǎng)細胞48 h，待細胞融合至80%左右，按照不同分組處理，采用Cleaved caspase-3抗體、DAPI 和熒光二抗孵育，熒光倒置顯微鏡觀察托烷司瓊預處理后缺氧/復氧心肌細胞細胞質(zhì)中Cleaved caspase-3的表達情況。

1.8Western blot檢測將H9C2心肌細胞消化重懸，細胞計數(shù)后，利用6孔板細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞48 h，待細胞融合至80%左右按照不同分組處理后提取蛋白，將收集的蛋白樣品分別加入12%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜2 h，用5%脫脂牛奶封閉1 h 30 min后，將聚偏氟乙烯膜放置于抗體盒內(nèi)4℃冰箱孵育過夜。第2天，用TBST洗滌后與相應的二抗在搖床上室溫下孵育2 h，再次洗膜后進行顯色。

2 結(jié) 果

2.1 ELISA法檢測與正常組比較，缺氧/復氧組TNF-α、IL-1β和LDH濃度明顯增加(P<0.01)；與缺氧/復氧組比較，托烷司瓊處理組 TNF-α、IL-1β和LDH濃度明顯減少(P<0.05)。見圖1。

2.2托烷司瓊對p-p38、p-pka和Cleaved caspase-3蛋白表達的影響托烷司瓊組較缺氧/復氧組p-p38、Cleaved caspase-3表達下調(diào)，p-pka表達水平升高(P<0.05)。見圖2，表1。與正常組相比，缺氧/復氧組Cleaved caspase-3表達明顯升高，而托烷司瓊組Cleaved caspase-3表達降低(P<0.05)。見圖3，表1。

1：正常組；2：溶劑對照組；3：缺氧/復氧組；4：托烷司瓊組

1:正常組；2：溶劑對照組；3：缺氧/復氧組；4：托烷司瓊組

表 1 Tro預處理后蛋白相對表達量

圖 3 鏡下觀察各組心肌細胞Cleaved caspase-3細胞形態(tài)(免疫熒光染色 ×100)

2.3托烷司瓊處理前預給MLA對p-p38和Cleaved caspase-3蛋白的影響與缺氧/復氧組比較，托烷司瓊組p-p38和Cleaved caspase-3蛋白表達均降低(P<0.01)； 與托烷司瓊組相比，托烷司瓊+MLA拮抗劑組p-p38和Cleaved caspase-3蛋白表達均升高(P<0.05)。見圖4，表2。

1：缺氧/復氧組；2：MLA拮抗劑組；3：托烷司瓊組；4：托烷司瓊+MLA拮抗劑組

表 2 Tro處理前預給MLA對p-p38和Cleaved caspase-3相對表達量

3 討 論

在心肌缺血再灌注損傷中，心肌缺血會引起大量致炎因子釋放，而再灌注是治療心肌缺血的主要方式之一，但在改善血供的同時，也會進一步加重心肌損傷導致心功能下降[9-10]。因此，MIRI的治療成為目前臨床的研究熱點，這對缺血性心肌病患者的預后與康復具有重要意義。H9C2心肌細胞是一種具有胚胎起源的大鼠左心室細胞，可代替原代心肌細胞作為模擬心肌缺血再灌注損傷的體外模型[11]。因此本文通過缺氧12 h復氧6 h成功建立H/R模型，觀察托烷司瓊預處理對H9C2心肌細胞的保護作用與機制。

本實驗觀察到H/R后細胞明顯發(fā)生皺縮、變圓、大量死亡。CCK-8法檢測在1～1000 nmol/L濃度的托烷司瓊對心肌細胞存活率不產(chǎn)生影響，這與Asadi等[12]發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致，在1 pmol/L至1 μmol/L的托烷司瓊濃度范圍內(nèi)孵育H9C2心肌細胞沒有任何毒性作用。而在缺氧前給予不同劑量托烷司瓊預處理發(fā)現(xiàn)在10、100 nmol/L濃度時細胞活性得到明顯改善。并且10 nmol/L濃度托烷司瓊預處理H/R可減少TNF-α、IL-1β、LHD釋放，同時抑制Cleaved caspase-3表達水平。以往研究表明，在阿奇霉素誘導心肌毒性損傷中，托烷司瓊可降低血清中心肌損傷指標，改善大鼠心電圖與心肌收縮力的變化[13]。在膿毒癥引起的心肌病中，托烷司瓊也可通過抑制炎癥反應調(diào)節(jié)大鼠心臟動作電位對心肌產(chǎn)生保護作用[14]。因此我們推測托烷司瓊可抑制細胞炎癥反應所導致的凋亡對H/R損傷起到心肌保護作用。

托烷司瓊不僅作為一種5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)3受體拮抗劑，并且是一種選擇性α7nAchR激動劑[15]。同時研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞存在α7nAchR，通過激活α7nAchR可減輕心肌缺血再灌注損傷[16]。MLA作為一種α7nAchR的競爭性拮抗劑，可通過抑制α7nAchR拮抗托烷司瓊對谷氨酸誘導的視網(wǎng)膜興奮性毒性的改善，增加p38 MAPK磷酸化水平促進細胞凋亡[6]，因此本文選擇MLA作為托烷司瓊的拮抗劑。蛋白激酶A(protein kinaseA，PKA)和p38 MAPK信號通路與MIRI有著密切的聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)激活PKA對心臟可產(chǎn)生保護作用，而再灌注早期產(chǎn)生大量的活性氧，可激活p38 MAPK表達增加，誘發(fā)細胞凋亡[17-18]。使用 p38 抑制劑 SB203580 預處理可通過降低氧化還原應激和細胞凋亡改善心肌缺血后大鼠心臟功能[19]。Aminzadeh發(fā)現(xiàn)托烷司瓊可通過抑制p38 MAPK信號通路降低PC12細胞中炎性因子濃度，同時減少Casepase-3表達，進而減輕海馬神經(jīng)炎癥反應，而這一效應與完全或部分激活α7nAchR有關[20]。我們的結(jié)果顯示，10 nmol/L劑量托烷司瓊H/R前預處理可降低p-p38、Cleaved caspase-3蛋白的表達，以及上調(diào)p-pka蛋白水平。而10nmol/L MLA明顯阻斷了10nmol/L劑量托烷司瓊對p-p38、Cleaved caspase-3蛋白表達的抑制作用。說明托烷司瓊可通過激活α7nAchR抑制p38 MAPK信號通路，發(fā)揮心肌保護作用。

綜上所述，托烷司瓊可通過激活α7nAchR抑制p38 MAPK信號通路，進而減輕H9C2心肌細胞缺氧/復氧產(chǎn)生的炎癥反應，抑制細胞凋亡，最終產(chǎn)生心肌保護作用，這為臨床治療提供了新的理論依據(jù)。因此托烷司瓊可能對心血管疾病特別是缺血性心肌病具有一定的治療和預防效果，臨床應用前景值得期待。