紫花蕓豆抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠肝臟及腸屏障損傷的修復(fù)作用

劉淑婷，王 穎,2,3,*，王志輝,2，王 迪，張艷莉，佐兆杭，王浩宇，鄧 薇

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319）

隨著消費(fèi)者生活方式和膳食結(jié)構(gòu)改變，高脂血癥患病率逐年攀升。大量數(shù)據(jù)表明，中國(guó)成年人高脂血癥患病率高達(dá)18.6%[1-2]。高脂血癥是心腦血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、缺血/溢血性中風(fēng)等病癥的重要發(fā)病因素[3]。高脂血癥是指由體內(nèi)血脂代謝紊亂引發(fā)血脂異常的一類代謝綜合類疾病統(tǒng)稱，而肝臟作為身體代謝的重要器官，在調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡方面起關(guān)鍵作用[4-6]。當(dāng)人體攝入和消耗的能量不平衡時(shí)，脂肪組織中過量的游離脂肪酸會(huì)將脂肪聚集在肝細(xì)胞中，使肝臟組織病變形成肝硬化、脂肪肝等病癥[7]。同時(shí)，高脂血癥誘發(fā)機(jī)體自由基蓄積、免疫功能紊亂、腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而損傷腸道功能?，F(xiàn)階段針對(duì)高脂血癥及其并發(fā)癥的傳統(tǒng)方法一般采取多種降脂藥物聯(lián)合干預(yù)的方式，其成本高昂、毒副作用大[8-9]。因此，探尋一種可通過膳食補(bǔ)充降低血液中甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）含量，有效改善高脂血癥的天然產(chǎn)物具有重要意義。

抗性淀粉是指在健康人體小腸中不被吸收，但在結(jié)腸中能被微生物完全或部分利用發(fā)酵產(chǎn)生對(duì)人體有益的短鏈脂肪酸的淀粉及其降解物，具有降低餐后血糖濃度、控制體質(zhì)量、改善腸道健康等生理功能[10-11]。目前，對(duì)抗性淀粉生理功能的研究主要集中在其參與糖代謝、調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防結(jié)腸癌等方面，在脂質(zhì)代謝方面的研究則更偏向于高直鏈玉米來源的抗性淀粉，Polakof等[7]研究發(fā)現(xiàn)Hi-Maize 260玉米抗性淀粉能有效改善高脂血癥大鼠胰島素抵抗造成的肝臟損傷。而對(duì)于雜糧豆類抗性淀粉的降脂護(hù)肝功能，尤其是對(duì)高脂造成的腸屏障損傷修復(fù)方面研究報(bào)道較少。蕓豆，作為小宗雜糧豆類，具有極高的食用和藥用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以墾區(qū)主產(chǎn)紫花蕓豆為原材料制備抗性淀粉，以高脂血癥大鼠模型為對(duì)象，研究蕓豆抗性淀粉對(duì)血脂異常導(dǎo)致的肝臟和腸屏障損傷的修復(fù)作用，旨在拓寬蕓豆的應(yīng)用領(lǐng)域，為蕓豆抗性淀粉在高脂血癥疾病方面的調(diào)節(jié)作用提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。

紫花蕓豆抗性淀粉由實(shí)驗(yàn)室自制；高脂血癥飼料北京科澳協(xié)力飼料有限公司；TG測(cè)試盒、TC測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒南京建成生物工程研究所；天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑片、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑片、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALKP）試劑片 北京安普生化科技有限公司；D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）測(cè)試盒 蘇州卡爾文生物技術(shù)有限公司；辛伐他汀片 山東鑫齊藥業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Vet Test 8008全自動(dòng)生化分析儀 北京安普生化科技有限公司；A360紫外分光光度計(jì) 上海翱藝儀器有限公司；Multiskan Sky全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器公司；AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫花蕓豆抗性淀粉的制備

工藝流程：紫花蕓豆粉→堿法提取[12]→淀粉→調(diào)漿→預(yù)糊化→超聲-微波協(xié)同處理[13]→壓熱→普魯蘭酶酶解[14]→滅酶→老化→烘干→粉碎過篩→純化[15]→紫花蕓豆抗性淀粉

操作要點(diǎn)： 1 ） 堿法提?。?氫氧化鈉溶液（0.2 g/100 mL）浸提時(shí)間3 h，固液比1∶7；2）超聲-微波協(xié)同壓熱酶解法制備紫花蕓豆抗性淀粉：淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，超聲-微波協(xié)同反應(yīng)儀溫度40 ℃，微波功率300 W，超聲-微波協(xié)同處理20 min后于121 ℃壓熱30 min，冷卻后調(diào)節(jié)至pH 5，酶添加量（9 ASPU/g，以干基質(zhì)量計(jì)），55 ℃恒溫酶解10 h，沸水浴滅酶。老化條件：4 ℃老化24 h。純化后抗性淀粉平均提取率為24.17%。

1.3.2 動(dòng)物分組與造模

健康Wistar大鼠（雄性）48 只，飼養(yǎng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)專用大鼠籠中。飼養(yǎng)條件：模擬循環(huán)光照12 h、室溫（24±2）℃、相對(duì)濕度（50±5）%。實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，稱量體質(zhì)量并記錄。

根據(jù)大鼠體質(zhì)量隨機(jī)分為6 組，即空白組、模型對(duì)照組、陽性藥物組、抗性淀粉處理組（高、中、低劑量組），每組8 只。所有大鼠每天自由飲水，空白組飼喂普通飼料，其余各組飼喂高脂血癥飼料，造模6 周。造模期間，每2 周剪尾取血一次，監(jiān)測(cè)血清TG和TC含量（與空白組相比，其余各組大鼠血清TC、TG含量升高2～3 倍即表示模型成立）。造模成功后，空白組和模型組大鼠每日灌胃生理鹽水；抗性淀粉處理組每日灌胃不同劑量蕓豆抗性淀粉；陽性藥物組灌胃辛伐他汀，具體灌胃劑量見表1。實(shí)驗(yàn)期間觀測(cè)大鼠日常精神、行為狀態(tài)，連續(xù)灌胃6 周后，最后一天禁食不禁水12 h，稱量大鼠體質(zhì)量并記錄[16]。實(shí)驗(yàn)鼠采取肌肉注射方式麻醉后，解剖，取肝臟、腹腔脂肪、小腸黏膜等組織分別稱質(zhì)量并記錄。按下式計(jì)算肝臟指數(shù)。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃藥劑設(shè)計(jì)Table 1 Grouping of experimental animals

1.3.3 血清指標(biāo)測(cè)定

大鼠解剖后，立即腹主動(dòng)脈取血，血液樣本室溫靜置30 min后4 ℃高速離心機(jī)離心，吸取上層血清分裝于滅菌EP管，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用全自?dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血液TC、TG濃度以及AST、ALT、ALKP活力，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)血液中抗氧化酶活力、DAO質(zhì)量濃度及D-LA濃度。

1.3.4 肝臟、小腸病理組織切片檢測(cè)

取肝臟右小葉及小腸黏膜組織，生理鹽水沖洗后吸水紙吸拭表面，于10%中性甲醛溶液固定用以制作蘇木精-伊紅切片，光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織并采集圖像[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 20軟件的方差分析法比較數(shù)據(jù)差異顯著性，P＜0.05及P＜0.01分別表示差異顯著和差異極顯著，用Origin軟件制作相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓豆抗性淀粉對(duì)大鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)及腹腔脂肪質(zhì)量的影響

圖1 各組大鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)及腹腔脂肪質(zhì)量Fig. 1 Body mass, liver index and abdominal fat mass of rats in each group

由圖1A可知，各組大鼠體質(zhì)量較空白組明顯升高，模型組與空白組體質(zhì)量差異極顯著（P＜0.01），表明高脂血癥大鼠建模成功。經(jīng)灌胃辛伐他汀及蕓豆抗性淀粉后，陽性對(duì)照組和抗性淀粉處理組大鼠體質(zhì)量均明顯下降；與模型組相比，蕓豆抗性淀粉低劑量組大鼠體質(zhì)量差異顯著（P＜0.05），其余各組大鼠體質(zhì)量差異極顯著（P＜0.01）。由圖1B可知，模型組大鼠肝臟指數(shù)與空白組大鼠相比存在極顯著差異（P＜0.01）；灌胃后，與模型組大鼠相比，除低劑量組，其他各灌胃組大鼠肝臟指數(shù)較模型組不同程度升高，差異顯著（P＜0.05）。由圖1C可知，模型組大鼠腹腔脂肪質(zhì)量較空白組大鼠存在極顯著差異（P＜0.01）。經(jīng)灌胃處理后，除低劑量組外，抗性淀粉中、高劑量組和陽性對(duì)照組大鼠腹腔脂肪質(zhì)量較模型組相比存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 蕓豆抗性淀粉對(duì)大鼠血脂和肝功能相關(guān)指標(biāo)的影響

圖2 蕓豆抗性淀粉對(duì)各組大鼠血清TC、TG濃度及ALKP、AST、ALT活力的影響Fig. 2 Effect of resistant starch from purple speckled kidney beans on serum total cholesterol and triglyceride concentrations and alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase activity in each group

如圖2所示，飼喂高脂飼料的模型組大鼠與空白組大鼠之間血清TC、TG濃度存在極顯著差異（P＜0.01），且模型組大鼠血清ALKP、AST、ALT活力顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對(duì)照組大鼠血清TC、TG濃度降低，其中TG濃度差異極顯著（P＜0.01），ALKP、AST、ALT活力極顯著降低（P＜0.01）?？剐缘矸酃辔父深A(yù)后，與模型組相比，中、高劑量組大鼠TC、TG濃度及ALKP、AST活力差異極顯著（P＜0.01），ALT活力差異顯著（P＜0.05）；低劑量組大鼠血清ALKP、ALT活力雖有一定程度下降，但不存在顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 蕓豆抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠氧化應(yīng)激的影響

如圖3所示，高脂血癥模型組大鼠血清SOD、GSH-Px活力相比于空白組大鼠極顯著降低（P＜0.01），MDA濃度極顯著升高（P＜0.01）。灌胃給藥后，與模型組大鼠相比，各灌胃組大鼠血清SOD和GSH-Px活力顯著回升（P＜0.05，P＜0.01），MDA濃度不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），但低劑量組MDA濃度差異不顯著。

圖3 蕓豆抗性淀粉對(duì)各組大鼠血清SOD、GSH-Px活力和MDA濃度的影響Fig. 3 Effect of resistant starch from purple speckled kidney beans on serum SOD, GSH-Px activity and MDA concentration in each group

2.4 蕓豆抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠腸屏障損傷的影響

由圖4可知，模型組大鼠血清DAO及D-LA水平較空白組大鼠極顯著升高（P＜0.01），灌胃后，各組大鼠血清DAO及D-LA水平較模型組呈不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），說明蕓豆抗性淀粉能在一定劑量下抑制DAO及D-LA的釋放。

圖4 蕓豆抗性淀粉對(duì)各組大鼠血清DAO、D-LA水平的影響Fig. 4 Effect of resistant starch from purple speckled kidney beans on serum DAO and D-LA levels in rats

2.5 大鼠肝臟及小腸病理組織切片觀察結(jié)果

圖5 大鼠肝臟病理組織蘇木精-伊紅染色觀察結(jié)果（×100）Fig. 5 HE staining of liver tissues of rats (× 100)

由圖5可知，空白組大鼠肝臟小葉組織細(xì)胞整體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，胞核清晰可見，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈以散射狀規(guī)整排列形成細(xì)胞索胞間，無明顯邊界分隔。而模型組大鼠肝臟組織腫大變性，損傷嚴(yán)重。肝細(xì)胞膨大腫脹，細(xì)胞核清晰可見但分布偏離，細(xì)胞漿質(zhì)間充盈著大量形狀大小各異的脂肪滴空泡，可觀察到大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪性病變。灌胃處理后，辛伐他汀組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰完整，肝細(xì)胞索排列整齊，僅存在極少量脂滴空泡，接近空白組大鼠肝臟切片結(jié)果。與模型組相比，蕓豆抗性淀粉各劑量組大鼠肝臟損傷程度顯著減輕，中、高劑量組大鼠肝細(xì)胞腫脹程度改善明顯，未出現(xiàn)明顯細(xì)胞變性壞死現(xiàn)象，雖偶見脂肪空泡，但肝細(xì)胞索排列清晰，而低劑量組大鼠可見清晰肝細(xì)胞索但排列紊亂，空泡數(shù)量減少，但仍存在較大脂滴空泡，表明不同劑量蕓豆抗性淀粉對(duì)大鼠肝臟損傷的修復(fù)程度不同。

圖6 各組大鼠小腸組織蘇木精-伊紅染色觀察結(jié)果（×100）Fig. 6 HE staining of small intestine tissues of rats in each group (× 100)

由圖6可知，模型組大鼠小腸組織形態(tài)受損，腸絨毛倒伏、脫落缺失，絨毛高度降低且參差不齊；腸黏膜肌層厚度降低，間隙寬大，隱窩深度增加。灌胃給藥后，各組大鼠小腸組織形態(tài)較為完整，層次分明，與模型組大鼠相比，各灌胃組大鼠小腸絨毛高度顯著增加，腸黏膜間連接緊密，肌層厚度增加，隱窩深度降低，表明蕓豆抗性淀粉能在一定程度減緩高脂血癥對(duì)大鼠小腸黏膜機(jī)械屏障損傷。

3 討 論

長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)影響肝臟代謝，打破能量平衡，破壞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。Stancu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飲食中的飽和脂肪和過量膽固醇可能會(huì)激活小腸和肝臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激，引發(fā)肝臟及腸道功能損傷?？剐缘矸郾徽J(rèn)為是功能性膳食纖維的一種，可抵抗人體小腸消化，被結(jié)腸菌群利用發(fā)酵對(duì)機(jī)體產(chǎn)生積極作用[21]。研究表明，多食用富含抗性淀粉等膳食纖維類食物能降低高脂血癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[22]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥與血清中TC和TG水平密切相關(guān)[23]。當(dāng)血液TC、TG水平高于正常水平時(shí)，血液內(nèi)附著物增多，黏稠度升高，堵塞血管造成組織缺血性壞死，誘發(fā)大鼠肥胖致使腹腔脂肪堆積。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠基本狀況指標(biāo)及血脂水平，結(jié)果表明灌胃蕓豆抗性淀粉后，中、高劑量組大鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)、腹腔脂肪質(zhì)量顯著降低。這與Lockyer等[24]的研究結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)抗性淀粉能量值為一般碳水化合物熱量的10%，約為8.37 kJ/g，其可作為低能量物質(zhì)減少機(jī)體能量攝入。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，抗性淀粉是3 個(gè)或3 個(gè)以上單體單元的碳水化合物聚合物，由大量的直鏈淀粉分子經(jīng)歷老化重結(jié)晶過程形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，難以在體內(nèi)被酶解消化，說明抗性淀粉的攝入可延緩胃排空率、縮短其在腸道運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間、控制體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)化，在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，刺激膽汁酸分泌增加，干預(yù)TG和膽固醇的合成，從而降低血清TG和TC的濃度，與本實(shí)驗(yàn)中灌胃組大鼠血脂濃度降低結(jié)果一致，證實(shí)紫花蕓豆抗性淀粉能在一定劑量下控制體質(zhì)量，減輕腹腔脂肪質(zhì)量，改善血脂水平。

高脂血癥病發(fā)時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生過量脂類物質(zhì)進(jìn)入肝臟，肝臟超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)使脂肪堆積，造成肝臟脂肪性病變，引發(fā)肝功能異常。ALKP和ALT主要分布在肝細(xì)胞中，AST分布在線粒體中，三者作為肝臟內(nèi)關(guān)鍵的功能性酶，可從受損的肝細(xì)胞質(zhì)分泌進(jìn)入血液[25]，因此血液中ALKP、AST、ALT活力可衡量肝臟損傷程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組大鼠相比，不同劑量組大鼠血清中ALKP、AST、ALT活力均呈不同程度下降。結(jié)合肝臟病理切片結(jié)果可知，各灌胃劑量組大鼠肝臟組織損傷程度較模型組大鼠顯著減輕，說明蕓豆抗性淀粉對(duì)高脂血癥大鼠肝功能損傷具有一定的修復(fù)作用，可減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提升細(xì)胞活力。

高脂血癥會(huì)引發(fā)機(jī)體游離脂肪酸和自由基增多，破壞體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)[26]，加劇肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂肪酸過氧化，造成肝臟損傷。而肝臟是第一個(gè)通過門靜脈獲得內(nèi)源性代謝產(chǎn)物和外源性代謝產(chǎn)物的器官，也是血脂與脂蛋白結(jié)合和代謝關(guān)鍵場(chǎng)所[27]，其借助肝門靜脈與腸道互聯(lián)，兩者通過血液回流和肝腸循環(huán)的方式相互調(diào)節(jié)，使得肝臟疾病與腸屏障功能密切相關(guān)。當(dāng)腸道功能受損時(shí)，腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接被破壞，導(dǎo)致機(jī)械屏障通透性增加，D-LA和DAO分別作為腸內(nèi)微生物發(fā)酵產(chǎn)物及細(xì)胞漿中高活性酶被分泌到血液中。實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定機(jī)體氧化酶活性及血清D-LA和DAO判斷機(jī)體氧化應(yīng)激及腸屏障損傷程度，結(jié)果表明SOD和GSH-Px活力升高，MDA水平、DAO及D-LA活力降低。分析可能是機(jī)體攝入抗性淀粉時(shí)，抗性淀粉進(jìn)入結(jié)腸，產(chǎn)生的短鏈脂肪酸被機(jī)體吸收進(jìn)而影響腸道激素合成。此時(shí)外源性代謝產(chǎn)物從腸道通過門靜脈循環(huán)進(jìn)入肝臟潛在地調(diào)節(jié)肝臟代謝[28]，抑制了膽固醇合成并刺激脂肪酸分解代謝，通過減少脂質(zhì)過氧化物的形成，緩解機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕對(duì)腸道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響，提高腸道上皮細(xì)胞活性[29]。結(jié)合小腸黏膜切片可知，蕓豆抗性淀粉組大鼠小腸黏膜組織完整，絨毛高度增加，隱窩深度降低，說明一定劑量的蕓豆抗性淀粉可通過清除機(jī)體自由基起到抗氧化應(yīng)激作用，從而減緩高脂血癥造成的肝臟損傷，近一步修復(fù)肝臟代謝障礙所致的腸屏障損傷。

綜上所述，蕓豆抗性淀粉具有良好的控制大鼠體質(zhì)量，降低血脂，修復(fù)高脂血癥大鼠肝臟及腸道屏障損傷作用，且中、高劑量組較低劑量組效果更顯著。本研究可為雜糧豆類抗性淀粉在高脂血癥造成的肝損傷及腸屏障修復(fù)方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。