不同國(guó)家和地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品及其發(fā)酵微生物研究進(jìn)展

劉飛翔，董其惠，吳 蓉，邱益彬，黃燕燕，蘇二正,4,*

（1.南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.亳州學(xué)院生物與食品工程系，安徽 亳州 236800；3.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；4.南京林業(yè)大學(xué)林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037）

自人類文明誕生以來(lái)，發(fā)酵技術(shù)就成為人們加工和保藏食品的重要工藝方法之一[1-2]。在新石器時(shí)代，人類就采用了發(fā)酵方式保存易腐敗的食物[3-4]。在隨后的幾千年里，各個(gè)地區(qū)不斷出現(xiàn)發(fā)酵飲料、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵面團(tuán)、發(fā)酵香腸等傳統(tǒng)的發(fā)酵食品。這些發(fā)酵食品對(duì)于科技不發(fā)達(dá)的古代人們而言，起到了保藏食品、豐富食品種類和有益身體健康的作用。即使是現(xiàn)代，對(duì)于一些經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的發(fā)展中國(guó)家，特別是對(duì)非洲地區(qū)的人們，發(fā)酵食品對(duì)于其日常飲食健康的作用依然十分明顯[5]。

由于世界上各個(gè)地區(qū)的飲食習(xí)慣以及工業(yè)化水平的發(fā)達(dá)程度不同，導(dǎo)致各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的發(fā)酵食品的種類、工藝方法和監(jiān)管措施有所不同。歐洲等發(fā)達(dá)地區(qū)的發(fā)酵食品商品化程度高，而非洲、亞洲和拉丁美洲等的發(fā)展中國(guó)家以傳統(tǒng)家庭式發(fā)酵食品為主，但隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，有些傳統(tǒng)發(fā)酵食品正在逐漸消失[6]。以特定菌種為發(fā)酵劑的商品化發(fā)酵食品可以使產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定和安全，但往往不具備傳統(tǒng)家庭手工發(fā)酵食品所具有的風(fēng)味。因此，近些年“天然”的家庭手工發(fā)酵食品更加受到人們的喜愛，但為了滿足不斷擴(kuò)大的市場(chǎng)又必須進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)[2]。

自微生物學(xué)家列文虎克發(fā)現(xiàn)并描述微生物起，人類開始逐步認(rèn)識(shí)到微生物對(duì)于生產(chǎn)和生活的重要性。對(duì)于自然發(fā)酵的傳統(tǒng)發(fā)酵食品而言，通常同時(shí)含有細(xì)菌、酵母和霉菌中的許多菌株。在發(fā)酵過(guò)程中，由于食品基質(zhì)、工藝操作和微生物與微生物間相互作用等因素，使得某些微生物類群可以暫時(shí)占據(jù)主導(dǎo)地位。微生物的演替過(guò)程中，不同的微生物類群相繼發(fā)揮其功能，最終形成質(zhì)量獨(dú)特的發(fā)酵食品。研究者們采用分離培養(yǎng)的方法，以揭示發(fā)酵食品中的微生物類群和演替規(guī)律。近年來(lái)，隨著分子測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，特別是高通量測(cè)序的應(yīng)用，人們得以逐漸認(rèn)識(shí)各種發(fā)酵食品中微生物群體的多樣性分布、菌種間的相互作用、產(chǎn)品品質(zhì)以及食品安全問(wèn)題。

為此，本文從各個(gè)地區(qū)發(fā)酵食品的種類、主要食品微生物類群與監(jiān)管制度、微生物群體對(duì)發(fā)酵食品的作用、食品微生物間的相互作用和宏組學(xué)方面在食品微生物中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 發(fā)酵食品、食品微生物及其監(jiān)管制度

1.1 發(fā)酵食品的定義與分類

發(fā)酵食品是指通過(guò)微生物或酶的作用，使原料基質(zhì)發(fā)生有益的化學(xué)變化，從而得到質(zhì)地、口感和營(yíng)養(yǎng)俱佳的食品[3,7-8]。世界各地的發(fā)酵食品根據(jù)原料的不同大致可分為9 類：動(dòng)物奶類、谷物類、肉類、豆類、蔬菜類、植物根莖類、魚類、酒精飲料類及其他[8-10]（表1）。由于世界各地農(nóng)作物的主產(chǎn)區(qū)不同，使得傳統(tǒng)發(fā)酵食品有著很強(qiáng)的地域民族特色。

表1 世界各地發(fā)酵食品的主要分類Table 1 Categories of fermented foods from around the world

1.2 食品微生物的定義和范疇

2012年，歐洲食品和飼料協(xié)會(huì)對(duì)食品用微生物給出了明確的定義，即可用于食品生產(chǎn)的活的細(xì)菌、酵母和霉菌[18]。

幾乎在所有的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中都會(huì)有細(xì)菌的參與，其中最主要的類群是乳酸菌。乳酸菌包含了大約4 0 個(gè)屬的3 8 0 種細(xì)菌，主要的屬有Bifidobacterium、Enterococcus、Lactobacillus、Leuconostoc、Lactococcus、Pediococcus、Streptococcus、Tetragenococcus、Vagococcus和Weissella[19]。乳酸菌最主要的代謝功能是將食品基質(zhì)中的糖類轉(zhuǎn)化為乳酸，降低環(huán)境的pH值，從而達(dá)到防腐保藏食品的目的。此外，乳酸菌還可代謝產(chǎn)生其他類型的有助于改善食品風(fēng)味、增強(qiáng)食品營(yíng)養(yǎng)和安全性的化合物，其機(jī)理將在下文中具體介紹。除了乳酸菌，一些發(fā)酵食品中還含有許多其他類型的細(xì)菌，如亞洲地區(qū)的發(fā)酵豆制品中含有芽孢桿菌屬（Bacillus），其最主要的功能是產(chǎn)生蛋白酶，將豆制品中的蛋白質(zhì)水解成更易消化吸收的功能性小分子多肽和氨基酸[12]；在果醋和泡菜的發(fā)酵過(guò)程中含有醋酸菌屬（Acetobacter），可將其他微生物代謝產(chǎn)生的乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸。

據(jù)報(bào)道，大約有21 個(gè)屬的酵母分別存在于不同的發(fā)酵酒精飲料和食品中，主要屬有Brettanomyces、Candida、Cryptococcus、Debaryomyces、Galactomyces、Geotrichum、Hansenula、Hanseniaspora、Hyphopichia、Kluyveromyces、Metschnikowia、Pichia、Rhodotorula、Saccharomyces、Saccharomycodes、Saccharomycopsis、Schizosaccharomyces、Torulopsis、Trichosporon、Yarrowia和Zygosaccharomyces[20]。其中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在面包、酒精性飲料等發(fā)酵食品中的應(yīng)用最為廣泛，在發(fā)酵過(guò)程中主要把小分子糖類轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳，也可代謝產(chǎn)生少量的其他風(fēng)味性物質(zhì)。

在亞洲地區(qū)許多發(fā)酵食品的制曲過(guò)程以及西方國(guó)家的奶酪和香腸的成熟過(guò)程中，霉菌也是主要的微生物之一。主要的類群包括Amylomyces、Aspergillus、Monascus、Mucor、Neurospora、Penicillium、Rhizopus和Ustilago[20]。這些霉菌在發(fā)酵食品中的主要作用是產(chǎn)生各種水解酶類，把食品基質(zhì)中的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為易吸收的小分子物質(zhì)，同時(shí)這些小分子物質(zhì)也有助于細(xì)菌和酵母的生長(zhǎng)代謝。

1.3 食品微生物的監(jiān)管制度

在過(guò)去的幾十年中，食品微生物的應(yīng)用直接或間接地被不同地區(qū)的監(jiān)管制度約束著。然而，不同地區(qū)的監(jiān)管體系中所規(guī)定的可用于食品的微生物清單卻不盡相同，為了防止誤用或亂用微生物的安全使用清單，需對(duì)各監(jiān)管體系建立微生物清單的方法原理有所了解[21]。

美國(guó)聯(lián)邦食品與藥品法規(guī)定，任何加入食品中的物質(zhì)都稱為食品添加劑，這些物質(zhì)在產(chǎn)品上市之前必須經(jīng)過(guò)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的審核和通過(guò)[22]。FDA采用“公認(rèn)安全物質(zhì)”（generally recognized as safe，GRAS）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)添加到食品中的添加劑進(jìn)行監(jiān)管。個(gè)人或公司可以向FDA提交某物質(zhì)屬于GRAS的申請(qǐng)，F(xiàn)DA審核通過(guò)后，某物質(zhì)便可作為添加劑添加到食品中。FDA每月會(huì)對(duì)GRAS清單進(jìn)行更新，截至到2019年7月，F(xiàn)DA官網(wǎng)公布的GRAS清單共847 條，其中與微生物相關(guān)的有253 條，共涉及81 種微生物。此外FDA也規(guī)定，對(duì)于1958年之前一直安全使用的添加劑，默認(rèn)屬于GRAS。食品微生物是發(fā)酵食品中的一部分，1958年之前的傳統(tǒng)發(fā)酵食品有著悠久的食用歷史，所以這些傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物自然也屬于GRAS的范疇[18]。

歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）從2007年開始通過(guò)安全資格認(rèn)證（qualified presumption of safety，QPS）體系，對(duì)食品微生物的安全性進(jìn)行監(jiān)管。與FDA類似，企業(yè)在使用不在QPS清單的微生物用于新食品生產(chǎn)時(shí)，必須提交申請(qǐng)，并對(duì)該微生物進(jìn)行安全評(píng)估。根據(jù)2019年最新更新的QPS清單，QPS體系將微生物分為5 類：革蘭氏陽(yáng)性不產(chǎn)孢子（59 種）；革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)孢子（15 種）；革蘭氏陰性菌（3 種）；酵母（16 種）；病毒（2 個(gè)科）[23]。2014年之前，QPS清單每年更新一次，此后每6 個(gè)月出一份聲明，每3 年出版一份意見。此外，歐盟也對(duì)具有食用歷史的食品做出了規(guī)定，1997年之前的食品不屬于新型食品[24]。因此，屬于傳統(tǒng)發(fā)酵食品一部分的微生物同樣不受新型食品的監(jiān)管。

2002年，國(guó)際乳品協(xié)會(huì)（International Dairy Federation，IDF）與歐洲食品與飼料菌種協(xié)會(huì)（European Food and Feed Cultures Association，EFFCA）出版了一份關(guān)于發(fā)酵乳制品的微生物清單，為乳制品行業(yè)提供參考。并在2012年，IDF/EFFCA將該清單范疇擴(kuò)展到了以肉、魚、豆類、蔬菜和谷物等為原料的傳統(tǒng)發(fā)酵食品領(lǐng)域[18]。IDF/EFFCA的微生物清單盡可能詳盡地列出了傳統(tǒng)發(fā)酵食品涉及的微生物種類，并保持不斷更新。根據(jù)2018年更新的清單，共列出了321 種或亞種微生物，其中原核類226 種，真菌類95 種[25]。

對(duì)比以上3 類食品微生物監(jiān)管體系及其清單發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DA的GRAS清單和EFSA的QPS清單的更新是建立在有企業(yè)或個(gè)人提交申請(qǐng)的基礎(chǔ)上的，是一種被動(dòng)的更新。而IDF/EFFSA清單是一種主動(dòng)的更新，微生物的種類比以上兩種清單要多很多。所以不在GRAS和QPS清單中的微生物并不一定是不安全的，可能是還沒(méi)有提交。值得注意的是IDF/EFFSA列出的微生物清單是指?jìng)鹘y(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物，而FDA和EFSA等許多地區(qū)對(duì)于傳統(tǒng)發(fā)酵食品種的微生物并沒(méi)有單獨(dú)一一列出，而是強(qiáng)調(diào)食品的安全使用歷史。此外，清單中的微生物往往都規(guī)定了其使用范圍，及用在何種發(fā)酵食品中，如果改變其原有用途，則需要重新向相關(guān)監(jiān)管體系重新提交申請(qǐng)[18]。

目前，我國(guó)在可用于食品的微生物（36 種）、嬰幼兒食品和保健食品益生菌（11 種）、保健食品真菌（11 種）中分別規(guī)定了相關(guān)微生物的清單，并強(qiáng)調(diào)“傳統(tǒng)上用于食品生產(chǎn)加工的菌種允許繼續(xù)使用”。但按照《新食品原料安全性審查管理辦法》，用于開發(fā)新食品的傳統(tǒng)食品中的微生物，則需要向國(guó)家相關(guān)部門重新提交申報(bào)和審批[26]。由于微生物在不同的食品基質(zhì)和微生物區(qū)系中，其新陳代謝的途徑已有所不同，因此將傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物在新食品中進(jìn)行應(yīng)用，需要重新考慮其安全性。

2 不同國(guó)家地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的種類和微生物類群

由于世界各地主要糧食作物、微生物環(huán)境和飲食習(xí)慣的不同，所以傳統(tǒng)地域性發(fā)酵食品的種類也隨之各異。隨著大航海時(shí)代的開始到當(dāng)今的全球化大發(fā)展，不同的發(fā)酵食品被不同文化的地區(qū)或國(guó)家逐漸接受。Soni[9]從全球視角綜述了發(fā)酵食品的主要類別，以一個(gè)整體的觀點(diǎn)識(shí)別各種發(fā)酵產(chǎn)品。本節(jié)從歐美、非洲、拉丁美洲和亞洲4 個(gè)地區(qū)，分別闡述當(dāng)?shù)赝林嗣竦闹饕膫鹘y(tǒng)發(fā)酵食品及其微生物類群，以揭示其主要特色和功能。

2.1 歐美地區(qū)

如表2所示，歐美國(guó)家的主要發(fā)酵食品主要包括面包、酸奶、奶酪、開菲爾、發(fā)酵香腸和葡萄酒等。埃及金字塔上的壁畫表明，在公元前3 000 年左右人類已經(jīng)開始學(xué)會(huì)制作面包[27]。烘焙面包是西方國(guó)家的主食之一，制作的主要原料為小麥粉、水、鹽和酵母菌，面團(tuán)經(jīng)發(fā)酵后在高溫烘焙形成面包；在和面過(guò)程中，也可加入乳酸菌劑、雞蛋、奶粉和乳化劑等可選的輔助材料，以產(chǎn)生不同風(fēng)味類型的面包[27]。在小麥和黑麥面包的制作時(shí)，古時(shí)人民往往將上批次發(fā)酵好的酸面團(tuán)留下小部分，作為下一批次和面時(shí)的發(fā)酵劑[28]。酸面團(tuán)中的酵母可產(chǎn)生醇、醛和酯等揮發(fā)性風(fēng)味化合物，從而賦予面包獨(dú)特的香甜味，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸是酸性面包的酸味來(lái)源[29]。同時(shí)，酵母和乳酸菌產(chǎn)生的二氧化碳?xì)怏w使面包形成蓬松的質(zhì)地。除了形成風(fēng)味化合物和特有的質(zhì)地外，發(fā)酵面包中水分的保持和抗真菌化合物的形成，可以延長(zhǎng)面包的保質(zhì)期。此外，酸面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生的生化反應(yīng)可以提高面包的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[27,30]。直到19世紀(jì)，商業(yè)化面包發(fā)酵劑開始應(yīng)用于工廠中面包的生產(chǎn)，但是酸面團(tuán)面包的獨(dú)特風(fēng)味和更加有益健康的優(yōu)點(diǎn)，使其更受人們歡迎[31]。

奶是哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的一種富含蛋白、脂肪、糖類、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)的分泌物，以保證初生后代的生長(zhǎng)發(fā)育。考古證據(jù)表明在公元前9 000 年，人類已在巖石上刻畫了擠奶的場(chǎng)景，表明人類很早就從馴化后的哺乳動(dòng)物汲取奶類，以增強(qiáng)自身的營(yíng)養(yǎng)，但是這些高營(yíng)養(yǎng)的自然奶同時(shí)也利于一些腐敗菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其不宜貯存[32]。在一些主產(chǎn)奶地區(qū)，人們把各種動(dòng)物奶通過(guò)發(fā)酵作用制作成酸奶、奶酪和開菲爾等奶制品。發(fā)酵奶制品中最常見的微生物為乳酸菌，例如酸奶是在嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌共同參與下形成的。除了乳酸菌等細(xì)菌以外，奶酪和開菲爾中還含有真菌[33-34]。發(fā)酵后的奶類，由于富含乳酸、細(xì)菌素等抗菌性物質(zhì)，能有效延長(zhǎng)防止腐敗菌或病原菌的生長(zhǎng)[35-36]。同時(shí)，酸奶中富含許多對(duì)人體健康有益的益生菌，如雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌等[37]。

在歐洲地區(qū)發(fā)酵香腸也有著悠久的食用歷史，一般采用豬肉或其他動(dòng)物的鮮瘦肉和鮮脂肪為主要原料，其發(fā)酵和后熟的過(guò)程中，會(huì)有乳酸菌、酵母和霉菌的參與，經(jīng)過(guò)微生物的新陳代謝和相互作用，便可形成風(fēng)味獨(dú)特的發(fā)酵香腸[11]。與其他發(fā)酵食品一樣，發(fā)酵后的香腸相對(duì)于其原料本身有著更長(zhǎng)的保質(zhì)期和更豐富的風(fēng)味物質(zhì)。

一些富含糖類的水果可經(jīng)發(fā)酵作用變成水果酒，最常見的水果酒為葡萄酒。根據(jù)葡萄的種類、發(fā)酵的方式可將葡萄酒分為若干類型，但所應(yīng)用的微生物均包括酵母菌和乳酸菌。酵母菌所主導(dǎo)的乙醇發(fā)酵是釀酒過(guò)程中的最主要的發(fā)酵過(guò)程，期間一些酵母菌可形成不同的特征型風(fēng)味物質(zhì)。此外，在葡萄酒發(fā)酵的后期，乳酸菌可將蘋果酸轉(zhuǎn)化形成乳酸，從而使酒體的酸味更加柔和[38]。

表2 歐美地區(qū)主要發(fā)酵食品的類別和主要微生物類群Table 2 Main microbial groups in various categories of fermented foods in Europe and America

2.2 非洲地區(qū)

由于非洲獨(dú)特的自然環(huán)境，使得該地區(qū)的農(nóng)作物以薯類為主，其次是谷物。谷物以玉米、高粱等粗糧為主，而營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高的大米和小麥很少種植。因此，非洲地區(qū)主要的發(fā)酵食品分為兩大類：發(fā)酵木薯類和發(fā)酵谷物類，但發(fā)酵奶制品和發(fā)酵蔬菜等發(fā)酵食品也少量存在。發(fā)酵谷物類，是以高粱粉、玉米粉和小米為原料，與水和成面團(tuán)后，經(jīng)乳酸菌和酵母自然發(fā)酵，再經(jīng)水蒸或烘烤制作而成，其制作過(guò)程類似西方的面包和我國(guó)的饅頭。在非洲不同的地區(qū)根據(jù)原料和具體工藝的不同，又可分為Hussuwa、Kenkey、Kisra和Injera等不同的發(fā)酵谷物食品[14]。另一種重要的發(fā)酵食品為發(fā)酵木薯，根據(jù)不同的地區(qū)發(fā)酵工藝的不同也可分為很多的類型，其中Gari是非洲分布最廣的發(fā)酵木薯食品[39]，其發(fā)酵過(guò)程涉及的微生物類群比較廣泛，包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母和霉菌。經(jīng)微生物發(fā)酵后，木薯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不僅可得到提升，還可去除其中的有毒物質(zhì)[2,39]。

2.3 拉丁美洲地區(qū)

同非洲地區(qū)類似，拉丁美洲地區(qū)的土著居民也主要使用谷物類和根莖類作為發(fā)酵食品的原料，但谷物類主要包括玉米、大米、花生和棉籽等，根莖類除了木薯以外還包括紅薯和馬鈴薯[40]。同樣的，由于不同的地理環(huán)境和文化信仰差異，該地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品也因地而異，大致分為非酒精性發(fā)酵飲料（Cauim、Yakupa、Pozol、Tejuino、Calugi）、酒精性飲料（Tarubá、Caxiri、Chicha、Champú、Pulque、Cacha?a）及其他發(fā)酵食品（Masa agria、Tocosh、Cacao）[40-41]。這些傳統(tǒng)發(fā)酵食品基本采用自然發(fā)酵的方式進(jìn)行，所涉及到的微生物基本包括酵母、乳酸菌、醋酸菌以及部分好氧的腸桿菌[41]。

非酒精性飲料多采用玉米和薯類作為原料，發(fā)酵后具有清爽提神的作用，是拉丁美洲地區(qū)土著人民日常飲食的一部分。以木薯為原料的Cauim為例，其制作流程為：首先將木薯進(jìn)行浸泡、削皮、切片、日曬、粉碎、調(diào)漿和蒸煮處理，再加入經(jīng)人口腔咀嚼后的木薯，最后發(fā)酵24～48 h后，可直接飲用[42]。咀嚼后的木薯中含有人的唾液淀粉酶，可將淀粉成分水解為小分子的發(fā)酵糖類。采用咀嚼將淀粉酶添加原料中的方式，同樣出現(xiàn)在酒精性飲料的產(chǎn)品中。以Chicha為例，南美地區(qū)土著部落中的婦女和孩子坐在一起，將咀嚼后的玉米吐到裝有溫水的容器中，經(jīng)發(fā)酵后便得到一種黃色的渾濁酒，乙醇體積分?jǐn)?shù)可達(dá)到6%左右[41]。由于不衛(wèi)生和潛在的危險(xiǎn)，使得這種方法在許多國(guó)家被禁止?，F(xiàn)在Chicha的生產(chǎn)采用經(jīng)浸泡發(fā)芽后含有淀粉酶的玉米進(jìn)行發(fā)酵，從而解決淀粉糖化的問(wèn)題，但此方式發(fā)酵后的酒產(chǎn)品卻缺少了原始發(fā)酵方式獨(dú)有的酸味[43]。酒精性飲料方面，拉丁美洲還有兩種蒸餾酒，即以甘蔗汁為原料的Cacha?a和以龍舌蘭屬植物為原料的龍舌蘭酒。除飲料外的其他發(fā)酵食品，主要包括發(fā)酵玉米面團(tuán)（Masa agria）、發(fā)酵土豆（Tocosh）和發(fā)酵可可（Cacao）。

2.4 亞洲地區(qū)

亞洲地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品主要有發(fā)酵豆制品、酒類、泡菜、饅頭、醋、發(fā)酵茶等。本節(jié)主要介紹特色鮮明的發(fā)酵豆制品、酒類和發(fā)酵蔬菜。

發(fā)酵豆制品大多起源于我國(guó)，如豆醬、醬油、豆豉、腐乳等在我國(guó)已有約2 000 年的食用歷史，后傳播到周邊國(guó)家，逐漸形成了自己獨(dú)特的產(chǎn)品，如日本的納豆和印度尼西亞的丹貝[44-45]。大部分發(fā)酵豆制品的工藝過(guò)程比較類似，以豆醬為例主要過(guò)程包括：浸泡、蒸煮、瀝干、制曲、加入鹽水和發(fā)酵[46]。傳統(tǒng)的自然制曲過(guò)程中，各種霉菌會(huì)在基質(zhì)表面生長(zhǎng)，并分泌許多水解酶類將大分子有機(jī)化合物水解為小分子類，結(jié)合后續(xù)細(xì)菌和酵母的發(fā)酵，便得到味道鮮美、醬香濃郁的豆醬。這種發(fā)酵后的黃褐色半固態(tài)醬醅，經(jīng)過(guò)濾得到的醬汁，可作為日常的調(diào)料品，即醬油[45]。值得一提的是，納豆的生產(chǎn)沒(méi)有制曲的過(guò)程，瀝干的大豆被包埋在經(jīng)水煮后的稻草中，水煮后的稻草含有耐高溫的芽孢桿菌屬細(xì)菌，接種到納豆后，經(jīng)約40 ℃發(fā)酵20 h左右即可得到表面富含黏性物質(zhì)的豆制品。這些發(fā)酵豆制品因含有活性肽、納豆激酶等生物活性物質(zhì)，因此也被認(rèn)為是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較高的功能性食品[44-46]。

亞洲地區(qū)的傳統(tǒng)酒類主要是以谷物原料釀造的黃酒、燒酒和白酒。黃酒起源于我國(guó)，在我國(guó)已約有5 000 年的歷史，在我國(guó)、韓國(guó)、日本和東南亞地區(qū)都有著傳統(tǒng)的飲用習(xí)慣，是著名的三大發(fā)酵酒之一[47]。黃酒的生產(chǎn)以糯米、稻米和小麥等為主要原料，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、儲(chǔ)存和煎酒等工藝單元釀造而成。黃酒的操作過(guò)程的特點(diǎn)是需加入麩曲作為糖化劑，水解產(chǎn)生的單糖可被酵母及時(shí)利用，從而實(shí)現(xiàn)邊糖化邊發(fā)酵的模式，可避免高糖濃度對(duì)酵母的影響，發(fā)酵終乙醇體積分?jǐn)?shù)最高可達(dá)20%[48]。黃酒的制曲和發(fā)酵的過(guò)程所涉及的微生物主要包括曲霉、根霉、毛霉、酵母、醋酸菌和乳酸菌等微生物[49]。自蒸餾技術(shù)出現(xiàn)后，將發(fā)酵后的黃酒蒸餾，便得到晶瑩透明的蒸餾燒酒，一般乙醇體積分?jǐn)?shù)在20%左右，目前該酒在日韓較流行。我國(guó)的白酒也屬于蒸餾酒，但采用固態(tài)發(fā)酵法釀制，釀造工序和涉及的微生物也比日韓的燒酒復(fù)雜的多。白酒除了水和乙醇這兩種主要成分外，還含有約1%的風(fēng)味物質(zhì)成分，其中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的風(fēng)味化合物多達(dá)一千多種，按照這些風(fēng)味化合物的組成比例，可將白酒分為12 種香型[50]。白酒釀造屬于開放式的自然發(fā)酵過(guò)程，釀造廠所周圍的特定環(huán)境和微生物區(qū)系，是形成不同風(fēng)味的白酒典型特征的主要原因之一。所涉及的微生物種類主要來(lái)自曲、酒醅和窖泥中，具體的物種也比較繁多，也正是這種復(fù)雜的微生物種類，才能形成白酒的眾多風(fēng)味化合物，造就白酒不同的風(fēng)格[51]。

蔬菜屬于季節(jié)性種植產(chǎn)品，古時(shí)人們采用發(fā)酵的方式可以很好地達(dá)到貯存的目的，并且在風(fēng)味口感上得到提升。所用原料也比較廣泛，主要包括白菜、甘藍(lán)、蘿卜、黃瓜等，加工制作過(guò)程中也可根據(jù)個(gè)人喜好，加入辣椒、花椒、生姜和酒等輔料[52]。發(fā)酵蔬菜主要包括醬菜、腌菜和泡菜[53]，其特點(diǎn)均包含加鹽腌制和乳酸菌發(fā)酵兩個(gè)過(guò)程[52]。高鹽分有利于植物上的一部分乳酸菌生長(zhǎng)，產(chǎn)生的乳酸使pH值降低，進(jìn)一步促進(jìn)了更多乳酸菌的生長(zhǎng)。此外，異型乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中，除產(chǎn)生乳酸外，產(chǎn)生的乙醇、乙酸等微量成分，有利于風(fēng)味物質(zhì)的進(jìn)一步形成。

3 微生物發(fā)酵對(duì)食品的作用

如圖1所示，食品微生物對(duì)食品的作用可概括為5 個(gè)方面：延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期、改善營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、去除抗?fàn)I養(yǎng)因子、改善腸道菌群和提升食品感官品質(zhì)[2,10,18,21]。

圖1 微生物發(fā)酵對(duì)食品的作用[2,10,18,21]Fig. 1 Effect of microbial fermentation on foods[2,10,18,21]

3.1 延長(zhǎng)食品保質(zhì)期

發(fā)酵食品最初的目的就是為了保藏食品，延長(zhǎng)食品的貨架期[2,54-55]。發(fā)酵保存食品的原理在于，碳水化合物及其衍生物會(huì)被氧化為有機(jī)酸類、醇類和二氧化碳等發(fā)酵的初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)可以抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)；并且這些物質(zhì)的氧化只是部分氧化，所以食品還保留足夠的營(yíng)養(yǎng)[2,54]。

許多發(fā)酵食品都含有乳酸菌，關(guān)于微生物延長(zhǎng)發(fā)酵食品保質(zhì)期的功能研究也多集中在乳酸菌類群上，研究表明乳酸菌類群中的一些菌種對(duì)于食品腐敗和致病菌有著較好的抑制作用[56-60]。乳酸菌在發(fā)酵食品中首先產(chǎn)生抑菌效應(yīng)，是乳酸菌通過(guò)產(chǎn)生的酸類物質(zhì)，降低基質(zhì)的pH值實(shí)現(xiàn)的[36]。其主要機(jī)理為：乙酸、乳酸、丙酸等有機(jī)酸可干擾細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的膜電位維持，抑制膜的主動(dòng)運(yùn)輸作用[61]。它們對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌以及酵母和霉菌均有抑制作用[2,62]。例如美國(guó)食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)的一種由費(fèi)氏丙酸桿菌Shermanii亞種（Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii）生產(chǎn)的富含丙酸的發(fā)酵液，可用于生產(chǎn)干酪[36]。乳酸菌除了產(chǎn)生上述的有機(jī)酸、醇類和二氧化碳，還可產(chǎn)生過(guò)氧化氫、雙乙酰等小分子抗菌物質(zhì)[60]。乳酸菌可在有氧條件下，由黃嘌呤氧化酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸過(guò)氧化物酶作用產(chǎn)生過(guò)氧化氫，其對(duì)膜脂和細(xì)胞蛋白有較強(qiáng)的氧化作用，從而達(dá)到抗菌的作用[63]。此外，乳酸菌通過(guò)檸檬酸代謝產(chǎn)生的雙乙酰，除了是許多發(fā)酵食品中的重要風(fēng)味物質(zhì)之一，也是重要的抗菌物質(zhì)之一，革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌對(duì)其較敏感[2,64]。

除以上小分子的抗菌物質(zhì)外，乳酸菌還可以產(chǎn)生一些被認(rèn)為是“天然防腐劑”的多肽物質(zhì)，稱為細(xì)菌素[35,65]。細(xì)菌素可以殺滅或抑制食品中的腐敗菌和病原菌，從而使其產(chǎn)生菌株或同種下的相近菌株獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[2]。細(xì)菌素的作用目標(biāo)往往是細(xì)胞膜，由于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外還有脂多糖的保護(hù)，因此細(xì)菌素只對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有活性[66]。對(duì)于革蘭氏陰性菌可采用食品級(jí)的螯合劑，如乙二胺四乙酸和檸檬酸鹽來(lái)去除其脂多糖的鎂離子，從而增加細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用效率[67]。因此產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株可作為發(fā)酵食品發(fā)酵劑的一部分或輔助物，以提高食品安全性和質(zhì)量。

細(xì)菌素相對(duì)于傳統(tǒng)抗生素的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是消化酶可以破壞它們，對(duì)人體健康沒(méi)有任何毒性影響，且沒(méi)有改變食物的感官特征，可作為化學(xué)防腐劑的替代品，所以將細(xì)菌素或產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌應(yīng)用于生物防腐領(lǐng)域，具有廣闊的前景[68-69]。目前乳酸鏈球菌素A/Z和片球菌素PA-1已經(jīng)被商業(yè)化生產(chǎn)，并被許多國(guó)家批準(zhǔn)使用[70]。乳酸鏈球菌素和片球菌素由于具有抗菌譜廣、低濃度抗菌能力強(qiáng)和穩(wěn)定性高等優(yōu)勢(shì)，所以也是被研究的熱點(diǎn)[69,71]。近些年有許多研究不斷發(fā)現(xiàn)新的細(xì)菌素種類，但產(chǎn)品的安全性和經(jīng)濟(jì)性是細(xì)菌素商業(yè)化的主要挑戰(zhàn)。

3.2 改善食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值

發(fā)酵過(guò)程中微生物可產(chǎn)生各種水解酶，將大分子的糖類、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)降解成更加容易吸收的功能性小分子活性物質(zhì)，從而增加食品的生物利用率，并產(chǎn)生功能性營(yíng)養(yǎng)成分[72]。

被降解的小分子物質(zhì)可為后續(xù)微生物發(fā)酵提供必備的物質(zhì)基礎(chǔ)，保障了發(fā)酵過(guò)程的順利進(jìn)行。在我國(guó)和亞洲其他地區(qū)，在制作白酒、醬油的過(guò)程中，往往先通過(guò)制曲的方式，從環(huán)境中富集大量微生物，使其誘導(dǎo)產(chǎn)生碳水化合物水解酶類、蛋白酶類和脂肪酶類。這些酶類將谷物原料中的大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)，從而可被后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中的釀酒酵母、乳酸菌等不可利用大分子的微生物吸收利用[2]。其次，在大分子水解的過(guò)程中可產(chǎn)生許多功能性小分子。例如，在亞洲的許多發(fā)酵豆制品中，原料中富含的蛋白質(zhì)可被芽孢桿菌（Bacillus sp.）產(chǎn)生的蛋白酶水解成生物活性肽[12]。發(fā)酵食品中的生物活性肽對(duì)人體免疫調(diào)節(jié)[73]、抗血栓[74]和抗高血壓[75]均有一定的功效。此外，食品發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酶類本身也具有一定營(yíng)養(yǎng)功效。如在我國(guó)，由面粉、青蒿、蒼耳草、辣蓼、赤小豆、苦杏仁和麥麩等經(jīng)天然發(fā)酵制成的六神曲，可被用于治療消化不良，其原理也在于曲中含有各種消化酶類[76]。又如，日本納豆中的枯草芽孢桿菌納豆亞種（Bacillus subtilis subsp. Natto）可產(chǎn)生納豆激酶，顯示具有纖溶活性，其可水解血管中纖維凝塊，從而有效治療和預(yù)防血栓[77]。

除了大分子的糖類、蛋白質(zhì)和脂肪，用于發(fā)酵食品的植物基原料中還含有大量的多酚類化合物，經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理后，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也可顯著提高[78]。在谷物、水果和蔬菜等植物中多酚類化合物的類群比較廣泛，比如，酚類化合物、類胡蘿卜素、花青素和生育酚等[79]。并且這些多酚類化合物，通常以酯鍵、醚鍵或糖苷鍵與細(xì)胞壁組分結(jié)合，從而以不溶形式存在。但在發(fā)酵過(guò)程中，微生物會(huì)產(chǎn)生不同的胞外酶，經(jīng)水解作用從基質(zhì)中提取或釋放多酚類物質(zhì)，同時(shí)通過(guò)微生物的二次代謝產(chǎn)生新的多酚類化合物[80]。例如在亞洲地區(qū)的許多發(fā)酵豆制品中，各種大豆異黃酮葡萄糖苷被水解成相應(yīng)的大豆異黃酮糖苷配基，相應(yīng)的發(fā)酵食品有我國(guó)的豆豉[81]、日本的納豆[82]等。

3.3 去除食品中抗?fàn)I養(yǎng)成分

一些用于食品發(fā)酵的原料含有一些有毒的物質(zhì)或者抗?fàn)I養(yǎng)因子，經(jīng)發(fā)酵處理后，其可被顯著去除[83]。最典型的例子是非洲的Gari和Fufu這兩種以木薯為原料的發(fā)酵食品。木薯是非洲地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，但由于含有生氰糖苷這一高毒性的物質(zhì)，其不可以直接食用[2]。木薯經(jīng)明串珠菌、乳酸菌和鏈球菌發(fā)酵后，生氰糖苷被轉(zhuǎn)化為低沸點(diǎn)的氫氰酸，在烘焙過(guò)程中從脫水漿中脫出，從而變成了可安全食用的發(fā)酵食品[84-85]。

植酸屬于植物基食品中一種廣泛的抗?fàn)I養(yǎng)因子，能很強(qiáng)地結(jié)合鐵、鋅等礦物質(zhì)，使它們無(wú)法在體內(nèi)吸收[86]。玉米、高粱和小米等不同谷物中的植酸，可通過(guò)乳酸發(fā)酵激活植酸酶，有效地減少植酸的含量，從而提高礦物質(zhì)的利用率[87]。

3.4 改善腸道菌群

益生菌是指當(dāng)被宿主以適當(dāng)劑量攝入時(shí)，能夠有益宿主健康，且具有生命活性的微生物類群[88]。食品中的益生菌，除了有上述提高食品的保質(zhì)期、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和安全性作用外，其對(duì)宿主腸道健康也有著很大的積極作用。益生菌必須具有抵抗胃液和膽汁的能力，并能夠在消化道中增殖和定植[89]。益生菌對(duì)宿主最顯著的益處在于可以抵抗腸道病原菌，其機(jī)理總結(jié)有4 點(diǎn)：競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、改變腸道的環(huán)境和提高宿主的免疫力[89]。

如表3 所示，常見的益生菌主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）[89]。近年來(lái)，酵母菌和其他微生物也被開發(fā)成為潛在的益生菌[90]。發(fā)酵乳制品是益生菌中乳酸菌最重要的傳統(tǒng)來(lái)源[72]。此外，在泡菜、香腸、紅酒等發(fā)酵食品中也可分離出許多的益生菌[91-92]。因此，食用富含益生菌的發(fā)酵食品，對(duì)身體健康有良多益處。

表3 可用作益生菌的微生物[89]Table 3 Microorganisms used as probiotics[89]

3.5 提升食品的感官品質(zhì)

微生物發(fā)酵可從食品的色、香、味和質(zhì)地4 個(gè)特征上提升食品的感官品質(zhì)[2,6,10,18,72]。食品中風(fēng)味包括了人口腔的味覺(jué)、鼻腔的嗅覺(jué)和三叉神經(jīng)的感覺(jué)[93]。發(fā)酵食品的風(fēng)味物質(zhì)可分為揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分。發(fā)酵食品的香氣成分是由揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，通過(guò)人的嗅覺(jué)被感知，令人愉悅的香氣可以增加人的食欲，增強(qiáng)人的消化功能；非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)通過(guò)味覺(jué)和三叉神經(jīng)的感覺(jué)被感知[93-94]。

發(fā)酵食品風(fēng)味物質(zhì)的形成主要包括原料基質(zhì)的水解反應(yīng)、微生物代謝產(chǎn)物的合成反應(yīng)或酶催化各分子進(jìn)行的生化反應(yīng)[95]。如前所述，發(fā)酵過(guò)程中微生物會(huì)產(chǎn)各種水解酶，將食品原料大分子物質(zhì)水解成小分子物質(zhì)。以富含蛋白質(zhì)的原料制品為例，蛋白質(zhì)經(jīng)水解后可形成不同氨基酸組成的多肽，這些多肽不僅具有生物活性功能還具有鮮味[96]。此外，還可水解產(chǎn)生游離的氨基酸，其中谷氨酸和天冬氨酸呈現(xiàn)鮮味，丙氨酸和甘氨酸呈現(xiàn)甜味[97-98]。經(jīng)酶解形成或原料中自身含有的小分子物質(zhì)可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或風(fēng)味物質(zhì)的前體，被微生物吸收和利用后產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物，或經(jīng)微生物產(chǎn)生的酶催化合成新的物質(zhì)，這是許多發(fā)酵食品風(fēng)味物質(zhì)的重要來(lái)源。如原料水解后的還原性單糖、氨基酸和脂肪酸可被酵母、乳酸菌等微生物吸收轉(zhuǎn)化為醇類、醛類、酸類、酯類、酮類、萜類和吡嗪等呈香呈味物質(zhì)[97,99-100]。

4 發(fā)酵食品中微生物間的相互作用與發(fā)酵劑的開發(fā)

4.1 食品微生物間的相互作用對(duì)發(fā)酵劑開發(fā)的意義

傳統(tǒng)發(fā)酵食品往往采用自然接種的方式，微生物來(lái)源于周圍環(huán)境和原料基質(zhì)本身，但微生物種類的波動(dòng)，或一些腐敗致病菌的出現(xiàn)，會(huì)直接影響到發(fā)酵的成功與否，并會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量和安全的不穩(wěn)定。為了能夠更好地對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行控制，人們采用特定菌種的發(fā)酵劑接種，或使用回滾方式進(jìn)行接種，即使用上批次成功發(fā)酵后的含有有益菌種的培養(yǎng)物接種[10,101]。但該方法的缺陷會(huì)造成產(chǎn)品失去多樣化，缺失地域風(fēng)格，所以家庭手工式發(fā)酵食品因具有獨(dú)特的風(fēng)味而更加受到人們的喜愛。為此，目前商業(yè)化的發(fā)酵劑面臨的挑戰(zhàn)之一就是使用發(fā)酵劑大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的發(fā)酵食品，但同時(shí)又不失去傳統(tǒng)產(chǎn)品的獨(dú)特風(fēng)味[2]。

目前使用的發(fā)酵劑主要是乳酸菌、酵母和一些霉菌，這些微生物經(jīng)過(guò)數(shù)千萬(wàn)年的進(jìn)化，通過(guò)基因的獲得和缺失的方式，使自身能夠在發(fā)酵食品的生物環(huán)境中獲得相應(yīng)的生態(tài)位[102]。發(fā)酵食品中這些特征型微生物被分離出來(lái)，被用作發(fā)酵劑，從而保證食品的穩(wěn)定性，但食品自然發(fā)酵過(guò)程中所涉及的微生物大多是復(fù)雜多樣的。多樣的微生物通過(guò)相互作用使自身的功能特性發(fā)生改變，從而使整個(gè)發(fā)酵食品系統(tǒng)內(nèi)的整個(gè)微生物體系的種類構(gòu)成和功能發(fā)生改變，最終將影響到發(fā)酵食品的品質(zhì)和安全性[103]。詳細(xì)了解這些交互作用是優(yōu)化和控制發(fā)酵食品質(zhì)量的先決條件[104]。目前很多文獻(xiàn)報(bào)道了發(fā)酵食品中微生物間的演替過(guò)程，但這些都屬于描述性的研究，微生物間相互作用的機(jī)理仍然不夠清晰，使得開發(fā)混合菌種的發(fā)酵劑遇到阻礙[101]。因此，厘清發(fā)酵食品中微生物間相互作用的機(jī)理，可以幫助人們開發(fā)出新的混合菌種的發(fā)酵劑，更好地調(diào)控發(fā)酵過(guò)程參數(shù)，從而生產(chǎn)出品質(zhì)穩(wěn)定、優(yōu)良的發(fā)酵食品。

4.2 食品微生物間相互作用類型與機(jī)制

微生物間的相互作用主要可分為5 種類型：偏害共生（-/0）、競(jìng)爭(zhēng)（-/-）、互利共生（+/+）、寄生（+/-）和偏利共生（+/0）[105-106]。偏害共生是指微生物產(chǎn)細(xì)菌素、有機(jī)酸和乙醇等發(fā)酵終產(chǎn)物對(duì)其他微生物造成傷害，而這些終產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)生菌無(wú)不利影響。例如，乳酸乳球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素可抑制李斯特菌或其他乳酸菌的生長(zhǎng)[101]。但這些終產(chǎn)物并不能保證其產(chǎn)生者在整個(gè)發(fā)酵食品的生態(tài)環(huán)境中占據(jù)主導(dǎo)地位，因?yàn)槿匀淮嬖谥恍?duì)這些抑菌物質(zhì)不敏感的菌種，與其爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間。這種相互爭(zhēng)奪基質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)與生存空間的相互作用稱為競(jìng)爭(zhēng)。例如，在一些食品的發(fā)酵過(guò)程中，微生物相互爭(zhēng)奪奶酪中的氮源、紅酒中的硫胺素等，這種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系在微生物的演替中起著決定性的作用[107]?；ダ采侵覆煌⑸镩g在共生的過(guò)程中均從對(duì)方受益的一種相互作用。典型的例子是在酸奶發(fā)酵過(guò)程中，保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）為嗜熱鏈球菌（Streptococcus salivariussubsp.thermophilus）提供多肽和氨基酸，嗜熱鏈球菌以此產(chǎn)生甲酸、葉酸和二氧化碳，反過(guò)來(lái)再促進(jìn)保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)[108-109]。偏利共生是指一種微生物因另一種微生物而受益，但另一種微生物不受影響的相互作用。如可以產(chǎn)蛋白質(zhì)水解酶的乳酸乳球菌陽(yáng)性菌株（prt+），可以向陰性菌株（prt-）提供氮源，但陽(yáng)性菌株本身不受影響。食品微生物中的寄生現(xiàn)象主要是指噬菌體的感染。噬菌體的寄生，一方面可通過(guò)噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，增加微生物物種間基因重組的概率，豐富遺傳的多樣性[110]；另一方面，可在微生物的演替中消滅有關(guān)微生物[111]。

上述各種相互作用的類型多是通過(guò)營(yíng)養(yǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)、功能的互補(bǔ)或產(chǎn)生抑制物等作用機(jī)制來(lái)介導(dǎo)的。此外，運(yùn)用細(xì)胞間群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）解釋食品微生物間相互作用的機(jī)制，是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一。據(jù)報(bào)道，在發(fā)酵蔬菜、酸面團(tuán)、乳制品、葡萄酒等多種不同發(fā)酵食品的生產(chǎn)過(guò)程中，存在大量微生物的QS，表明QS在這些發(fā)酵食品的發(fā)酵過(guò)程中起著重要的作用。如調(diào)節(jié)發(fā)酵食品中微生物的生物膜的形成、耐酸性脅迫、細(xì)菌素的產(chǎn)生、黏附、形態(tài)轉(zhuǎn)換和定向生長(zhǎng)等[112]。QS涉及到信號(hào)分子的合成、分泌和檢測(cè)。正在增殖的微生物細(xì)胞將合成的信號(hào)分子分泌到胞外，并且信號(hào)分子的濃度和細(xì)胞濃度成正比例關(guān)系，當(dāng)這些信號(hào)分子達(dá)到一定閾值時(shí)，細(xì)胞會(huì)相應(yīng)地同時(shí)調(diào)控自身相關(guān)基因的表達(dá)[113-114]。

目前細(xì)菌中報(bào)道的信號(hào)分子主要包括3 類：酰基高絲氨酸內(nèi)酯（acylhomoserine lactones，AHL）、自誘導(dǎo)多肽（autoinducer peptides，AIP）和自誘導(dǎo)物2（autoinducer-2，AI-2）[115]。AHL主要是革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的一種群體信號(hào)分子，當(dāng)AHL達(dá)到一定閾值濃度時(shí)，會(huì)和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白LuxR結(jié)合，從而啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但由于LuxR對(duì)AHL具有很強(qiáng)的特異性，因此AHL介導(dǎo)的QS用于種內(nèi)的信息交流。食品中許多的腐敗菌多屬于革蘭氏陰性菌，如熒光假單胞菌是發(fā)酵牛奶中主要的腐敗菌之一，其QS的信號(hào)分子為六烯基高絲氨酸內(nèi)酯，研究者通過(guò)添加呋喃有效抑制了腐敗菌的QS，從而延長(zhǎng)了發(fā)酵牛奶的保質(zhì)期[116]。

AIP作為革蘭氏陽(yáng)性菌QS系統(tǒng)中的信號(hào)分子，是一種分子質(zhì)量小且具有特異性的多肽類物質(zhì)。前文所述的細(xì)菌素屬于典型的AIP分子，對(duì)于發(fā)酵食品中微生物的演替和防腐起到重要作用。例如，在發(fā)酵蔬菜汁中，當(dāng)植物乳桿菌的細(xì)胞濃度達(dá)到一定時(shí)，植物乳桿菌素介導(dǎo)的QS系統(tǒng)可有效抑Bacillus megateriumF6的生長(zhǎng)[117]。

在許多的文獻(xiàn)報(bào)道中，AI-2在革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌中都有存在，且其合成相關(guān)的luxS基因在不同菌種之間具有高度的保守性，因此可把AI-2作為不同菌種間的通用“語(yǔ)言”，在種間和種內(nèi)的交流中起到重要作用[112]。AI-2是發(fā)酵食品中微生物的交替中起到重要作用，已經(jīng)在泡菜[118]、奶酪[119]、發(fā)酵肉制品[120]、酸面團(tuán)[121]中發(fā)現(xiàn)了AI-2的存在，發(fā)酵過(guò)程中不同微生物可通過(guò)感知食品基質(zhì)中AI-2的濃度獲取周圍環(huán)境信息，從而調(diào)控自身的生物行為。

此外，在真核微生物中也發(fā)現(xiàn)了QS的存在，但目前對(duì)真核微生物QS的機(jī)制了解甚少。在酵母已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的QS信號(hào)分子為法尼醇、酪醇、色醇和苯乙醇[112]。如前所述酵母是許多發(fā)酵食品中的主要微生物之一，有報(bào)道顯示，這些醇類分子對(duì)奶酪中的漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces Hansenii）的黏附和滑動(dòng)有著重要的影響[122]。

雖然QS在食品發(fā)酵過(guò)程中的許多微生物作用中起著重要的作用，但目前在食品發(fā)酵過(guò)程中對(duì)QS的了解還處于初級(jí)階段，而且有限的分析檢測(cè)工具使得用于實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵食品生態(tài)模型是被簡(jiǎn)化后的。隨著下一代測(cè)序、非培養(yǎng)等技術(shù)在微生物領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用，在未來(lái)人們可加深對(duì)發(fā)酵食品中QS的了解，使食品工業(yè)能夠積極利用QS在產(chǎn)品風(fēng)味、質(zhì)地和抑菌性等方面改善發(fā)酵食品[112]。

5 宏組學(xué)技術(shù)在發(fā)酵食品中的應(yīng)用

如前所述，微生物的群體種類和之間的相互作用，深刻影響著發(fā)酵食品的質(zhì)量和安全性。在過(guò)去，微生物學(xué)者們采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)，揭示了發(fā)酵食品中典型的微生物群落分布和演替規(guī)律。但是這些種群層面的描述性研究不能完全闡釋食品微生物對(duì)于發(fā)酵食品品質(zhì)影響的具體機(jī)理。并且對(duì)于復(fù)雜的微生物種群，有些發(fā)酵食品中存在著許多實(shí)驗(yàn)室還不可培養(yǎng)的微生物。此外，對(duì)于低豐度的微生物也可能不會(huì)被分離到，但這些低豐度的微生物可能對(duì)于產(chǎn)品的質(zhì)量起著重要的作用。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，基于核酸測(cè)序的非培養(yǎng)技術(shù)可以有效克服這些缺陷[123]。

2001年，在各國(guó)的努力下，科研人員采用桑格測(cè)序技術(shù)，花費(fèi)30億 美元，終于完成了人類基因組的計(jì)劃[124]。自此，不斷涌現(xiàn)出許多的測(cè)序技術(shù)。在近10 年，第二代高通量測(cè)序技術(shù)的到來(lái)，使得研究者可以以更少的花費(fèi)和更快的速度，獲得許多已知微生物的全基因組。這些基因組整合在一起，形成了一個(gè)公共性的龐大數(shù)據(jù)庫(kù)，為采用組學(xué)技術(shù)研究食品微生物提供了良好的基礎(chǔ)。對(duì)于發(fā)酵食品而言，通過(guò)提取整個(gè)樣品中所有微生物的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝物進(jìn)行研究稱為宏組學(xué)技術(shù)，相應(yīng)地涵蓋了宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)和宏代謝組學(xué)4 個(gè)方面[125-126]。

宏基因組學(xué)技術(shù)根據(jù)測(cè)序的內(nèi)容可為兩類：擴(kuò)增子測(cè)序和鳥槍法測(cè)序。擴(kuò)增子測(cè)序是采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)擴(kuò)增微生物特定的保守序列，然后進(jìn)入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而得出微生物的類群種類，根據(jù)讀段數(shù)的占比，得知相應(yīng)微生物的豐度[123]。被擴(kuò)增的保守序列，一般使用細(xì)菌的16S rRNA基因和真菌的rRNA基因的間隔區(qū)[127-128]?；跀U(kuò)增子測(cè)序的宏基因組學(xué)技術(shù)，在發(fā)酵食品中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在：可以更加快速準(zhǔn)確地揭示發(fā)酵食品不同生產(chǎn)和成熟過(guò)程中的微生物組成的差異[123]。由于該技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟且成本降低，目前相關(guān)的研究已經(jīng)很多，涵蓋了幾乎所有種類的發(fā)酵食品，如發(fā)酵奶類、豆類、肉類、谷物類、蔬菜類等。但由于這些基因的保守型，使得擴(kuò)增子測(cè)序在一些情況下只能鑒定到屬水平。此外，PCR的操作過(guò)程中，由于方法的偏好性，也不能保證所有的微生物全部被克隆[129-130]。鳥槍法測(cè)序是將樣品中所有微生物的DNA打斷，測(cè)序后再重新組合。所以，鳥槍法測(cè)序的片段數(shù)自然也比較多，費(fèi)用也遠(yuǎn)比擴(kuò)增子測(cè)序高。但鳥槍法測(cè)序不但可以得知樣品中的微生物分布和豐度，還可以根據(jù)特定的基因或基因簇預(yù)測(cè)微生物群體所具有的代謝潛能。雖然鳥槍法測(cè)序的應(yīng)用尚處于發(fā)展之中，但在發(fā)酵食品領(lǐng)域已有數(shù)篇相關(guān)報(bào)道，如奶酪[131]、韓國(guó)泡菜[132]和發(fā)酵可可豆[133]。以其中的韓國(guó)泡菜為例，通過(guò)基于鳥槍法測(cè)序的宏基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與單糖和寡糖代謝相關(guān)的Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 和Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K兩株菌的基因在微生物群中的豐度比較高，表明其在韓國(guó)泡菜的發(fā)酵過(guò)程中具有重要的作用[132]。在食品發(fā)酵的不同時(shí)間，由于微生物與微生物之間、微生物與環(huán)境之間的相互作用的變化，各微生物的基因表達(dá)情況也會(huì)不同，這種以mRNA為對(duì)象，研究在特定時(shí)間特定環(huán)境下的全部基因的轉(zhuǎn)錄水平稱為宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)在提取mRNA后，還需要將RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA文庫(kù)，然后同宏基因組測(cè)序步驟一樣用于測(cè)序。采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)奶酪皮進(jìn)行的分析表明，與蛋白水解和脂水解相關(guān)的基因在白地霉（Geotrichum candidum）中高度表達(dá)，這表明該物種對(duì)奶酪的風(fēng)味形成起著重要作用[134]。同樣地，采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法揭示了韓國(guó)泡菜風(fēng)味物質(zhì)形成相關(guān)的基因在腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）中高度表達(dá)[135]。

宏蛋白質(zhì)組學(xué)和宏代謝組學(xué)是對(duì)環(huán)境中微生物的全部蛋白質(zhì)組成和代謝產(chǎn)物組成研究的組學(xué)技術(shù)。將高通量測(cè)序技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合，可以更加清晰地從基因型到表現(xiàn)型水平上解釋發(fā)酵過(guò)程中微生物群體分布、相互作用和代謝產(chǎn)物的合成等之間的關(guān)系[126,130]。近些年，這種多組學(xué)結(jié)合的技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到了發(fā)酵食品領(lǐng)域，如普洱茶[136]、魚露[137]、鎮(zhèn)江香醋[17]和開菲爾[138]等。以發(fā)酵普爾茶為例，Zhao Ming等[136]首先采用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)確定普洱茶中的細(xì)菌和真菌組成，然后采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定微生物的蛋白質(zhì)組成。該研究結(jié)果表明，發(fā)酵普洱茶中的細(xì)菌主要為變形桿菌，真菌主要為曲霉，且75%的細(xì)菌蛋白來(lái)自變形桿菌，56.68%的真菌蛋白來(lái)自曲霉，這些結(jié)果為參與普洱茶發(fā)酵的微生物和相關(guān)蛋白的鑒定提供了直接證據(jù)，并表明真菌在這一過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

6 結(jié) 語(yǔ)

不同地區(qū)各具特色的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，凝聚了各民族勞動(dòng)人民的智慧。但目前許多發(fā)展中國(guó)家的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，仍然有待進(jìn)一步研究。雖然發(fā)酵食品相比于其原始未加工的原料，有著諸多的優(yōu)勢(shì)，但因發(fā)酵作用產(chǎn)生的一些對(duì)健康不利的物質(zhì)（如氨基甲酸乙酯、亞硝酸鹽等）同樣需要關(guān)注。為此，在評(píng)價(jià)一種發(fā)酵食品的優(yōu)劣時(shí)，應(yīng)當(dāng)從多角度分析，而不應(yīng)該只強(qiáng)調(diào)其益處，這樣消費(fèi)者才能更加合理選擇適合自己的產(chǎn)品。

隨著全球城鎮(zhèn)化的不斷加深，傳統(tǒng)發(fā)酵食品也必將逐步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，以滿足人們的需求。如何實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)而又不喪失發(fā)酵食品的傳統(tǒng)風(fēng)味，是研究人員面臨的最直接問(wèn)題之一。微生物是發(fā)酵食品中風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)者，其群體組成和動(dòng)態(tài)的演替關(guān)系影響著發(fā)酵食品的安全和品質(zhì)。已有許多企業(yè)通過(guò)接種商業(yè)化的微生物發(fā)酵劑，規(guī)模化生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量恒定的發(fā)酵食品。但目前的商業(yè)化發(fā)酵劑微生物組成依然比較簡(jiǎn)單，雖然可產(chǎn)生該類型產(chǎn)品的主要特征性風(fēng)味物質(zhì)，但可能整體上的風(fēng)味物質(zhì)種類相較于原始傳統(tǒng)發(fā)酵要少得多。

采用多組學(xué)結(jié)合技術(shù)，進(jìn)一步分析認(rèn)識(shí)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的特有基因庫(kù)和群體間的相互作用，可解釋發(fā)酵過(guò)程中功能性成分、危害成分和風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生途徑。并以此為基礎(chǔ)，優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程工藝和開發(fā)微生物組成更加合理的發(fā)酵劑。然而，目前宏組學(xué)技術(shù)依然面臨一些問(wèn)題，如數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)不夠豐富完備，以致某些樣品的序列無(wú)法得到比對(duì)或被正確地注釋。但隨著測(cè)序技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)和大數(shù)據(jù)分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，宏組學(xué)技術(shù)一定會(huì)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品產(chǎn)生更加深刻的積極影響。