樺木酸對環(huán)磷酰胺致小鼠肝臟損傷的保護作用

馬朝陽，朱利娟，羅晨曦，朱子寒，孔 麗，林 星，高鑫禹，馬玉容，歐朝萍，易金娥,2,3,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.畜禽保健湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CYP）屬于氮芥類烷化劑抗腫瘤藥，在臨床上使用超過40 年，主要用于癌癥、免疫缺陷類疾病的治療[1-2]，因其對組織缺乏特異選擇性，過量使用會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)受損，出現(xiàn)免疫缺陷[3]，并且還可能導(dǎo)致骨髓抑制、氧化應(yīng)激和其他副作用，甚至威脅生命[4]。CYP通過促進干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌，降低白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的分泌，破壞細胞免疫，抑制自然殺傷細胞和巨噬細胞，最終抑制機體的免疫功能[5]。潘航等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射CYP能夠降低胸腺、脾臟和血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，提高胸腺和脾臟中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。在臨床研究中，CYP常被用于免疫抑制模型和氧化應(yīng)激模型的建立。

樺木酸（betulinic acid，BA）屬于羽扇豆烷型五環(huán)三萜類物質(zhì)[7]，具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗菌[8]。BA廣泛分布于樺木屬植物和其他多種植物中，如酸棗仁、槐花、天門冬、睡菜葉等[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，BA具有免疫調(diào)節(jié)的作用，能夠增強小鼠的細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫[10-12]。BA對地塞米松致小鼠氧化應(yīng)激或?qū)凭愿螕p傷具有保護作用[13-16]，并且，BA對CYP引起的小鼠免疫器官氧化應(yīng)激有預(yù)防性保護作用[17]。然而BA是否對CYP引起的肝臟損傷具有改善和預(yù)防性保護作用還鮮見報道。因此，本實驗采用腹腔注射CYP誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷模型，從肝功能相關(guān)指標(biāo)、抗氧化能力以及抗炎作用來研究BA對其預(yù)防性保護作用，旨在為BA的臨床應(yīng)用及作為藥食同源物的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

50 只健康雄性昆明小鼠，4～5 周齡，無特定病原體（SPF）級，體質(zhì)量為（15±2）g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2009-0004。飼料為大小鼠維持飼料，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，其主要原料為玉米、小麥、豆粕、魚粉、啤酒酵母粉、苜蓿草粉、麥麩等；主要營養(yǎng)成分（以干質(zhì)量計）：粗蛋白（≥18%，質(zhì)量分數(shù)，下同）、粗脂肪（≥4%）、粗纖維（≤5%）、鈣（1.0%～1.8%）、磷（0.6%～1.2%）、賴氨酸（≥0.82%）、蛋氨酸+胱氨酸（≥0.53%）。

BA、CYP 美國Sigma公司；TRIzol提取試劑盒美國L i f e 公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（r e v e r s e transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、SYBR Green熒光染料 日本Takara公司；實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）引物上海生工生物工程股份有限公司；SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JXFSTPRP-24組織勻漿機 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；5404EQ220531高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；AY220電子分析天平 日本島津有限公司；BS-200自動生化分析儀 深圳邁瑞公司；Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀 美國Bio Tek公司；788BR03720 qPCR儀美國Bio-Rad公司；EM UC7超薄切片機 德國Leica公司；ECLIPSE C1正置顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組及喂養(yǎng)

根據(jù)前期研究，確定了BA和CYP的給藥時間和劑量[16,18]。將小鼠放置在環(huán)境溫度為22～25 ℃，相對濕度為40%～70%，氨濃度不超過14 mg/m3的飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)1 周后，隨機分為5 組，即空白組、CYP組以及BA低、中、高劑量（0.25、0.50、1.00 mg/kgmbBA+CYP）組，每組10 只。將不同劑量的BA混懸于質(zhì)量分數(shù)1%的可溶性淀粉糊，按0.01 mL/gmb灌胃，空白組和CYP組給予1%可溶性淀粉糊，每天9∶00給藥一次，連續(xù)給藥14 d。第15和第16天，CYP組，BA低、中、高劑量組腹腔注射50 mg/kgmbCYP誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型，空白組注射等量的生理鹽水。禁食16 h（自由飲水）后，眼眶采血，頸椎脫臼處死。血液在室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，收集血清用于檢測生化指標(biāo)。無菌條件下摘取肝臟（稱質(zhì)量），按下式計算肝臟指數(shù)。

一部分肝臟用預(yù)冷生理鹽水按1∶9（m/V）配制成10%組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min，收集上清液于用于檢測SOD、CAT、GSH-Px活力以及GSH和MDA含量。另一部分肝臟儲存于-80 ℃用于細胞因子mRNA的相對表達量檢測。

1.3.2 血清指標(biāo)檢測

用BS-200全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST的活力。

1.3.3 肝臟抗氧化能力指標(biāo)檢測

SOD活力采用羥胺法測定；GSH-Px活力和GSH含量均采用二硫代二硝基苯甲酸法測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定；CAT活力采用鉬酸銨比色法測定。SOD、CAT、GSH-Px、MDA和GSH水平的檢測均按試劑盒說明書嚴格操作。

1.3.4 qPCR檢測肝臟炎性因子相關(guān)基因的表達量

1.3.4.1 引物的設(shè)計

按照qPCR引物設(shè)計要求來設(shè)計引物，引物見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.4.2 表達量的測定

取0.06 g肝組織進行勻漿，使用TRIzol法提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR儀反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green I試劑盒和qPCR儀對目的基因相對表達量進行測定。目的基因的表達以β-actin作為內(nèi)參進行矯正，保存數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析進行差異顯著性比較，兩兩比較采用q檢驗，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 BA對小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

由圖1 可見，各組小鼠初始體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05）；實驗結(jié)束后，與空白組相比，CYP組小鼠體質(zhì)量差異不顯著（P＞0.05），肝臟指數(shù)增加，但差異不顯著（P＞0.05）；與CYP組相比，BA預(yù)處理使小鼠體質(zhì)量增加，以0.50 mg/kgmbBA差異顯著（P＜0.05），同時使肝臟指數(shù)降低，以0.50 mg/kgmb和1.00 mg/kgmbBA差異顯著（P＜0.05）。

圖1 BA對CYP致小鼠初始（A）、終末（B）體質(zhì)量和肝臟指數(shù)（C）的影響Fig. 1 Effect of BA on initial body mass (A), final body mass (B) and liver index (C) of mice with CYP-induced liver injury

2.2 BA對CYP致小鼠血清酶活力的影響

圖2 BA對CYP致小鼠血清AST（A）和ALT（B）活力的影響Fig. 2 Effect of BA on the activities of AST (A) and ALT (B) in serum of mice with CYP-induced liver injury

由圖2可見，與空白組相比，CYP組小鼠血清中AST和ALT的活力極顯著升高（P＜0.01）；與CYP組相比，BA呈劑量依賴性降低AST的活力，其中以1.00 mg/kg mbBA組差異顯著（P＜0.05）；同時，BA降低血清中ALT活力，以0.50 mg/kg mbBA組差異顯著（P＜0.05）。

2.3 BA對CYP致小鼠肝組織病理變化的影響

圖3 蘇木精-伊紅染色觀察BA對CYP致小鼠肝組織病理變化的影響（20×）Fig. 3 Effect of BA on pathological changes of liver tissues from CYP-induced mice (20 ×)

由圖3可見，空白組肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇結(jié)構(gòu)整齊；CYP組肝小葉界限模糊，細胞核周圍出現(xiàn)大量空泡；BA預(yù)處理后，由CYP引起的肝細胞空泡樣變性緩解，以0.50 mg/kg mbBA組改善作用最為明顯。

2.4 BA對CYP致小鼠肝臟氧化指標(biāo)的影響

圖4 BA對CYP致小鼠肝臟SOD（A）、GSH-Px（B）、CAT（C）活力和GSH（D）、MDA（E）含量的影響Fig. 4 Effect of BA on the levels of SOD (A), GSH-Px (B), CAT (C) and GSH (D), and MDA (E) in liver tissues of CYP-treated mice

由圖4可見，與空白組對比，CYP組的SOD活力和GSH含量顯著上升（P＜0.05），GSH-Px活力和MDA含量升高，CAT活力下降，但差異不顯著（P＞0.05）；與CYP組對比，BA預(yù)處理導(dǎo)致SOD的活力下降，以0.25 mg/kg mbBA組差異顯著（P＜0.05）；GSH含量變化無顯著性差異（P＞0.05）；BA預(yù)處理對肝臟GSH-Px和CAT活力無顯著差異（P＞0.05）；各BA組的MDA含量均呈下降趨勢，差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 BA對CYP致小鼠肝臟細胞因子的影響

由圖5 可見，與空白組相比，C Y P 組的I L-1 β和TNF-α mRNA表達量極顯著升高（P＜0.01），IL-6 mRNA表達量極顯著降低（P＜0.01），IL-10 mRNA表達量略微降低（P＞0.05）。與CYP組相比0.25 mg/kg mb和1.00 mg/kg mbBA預(yù)處理后，IL-1β mRNA的表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），但0.50 mg/kg mbBA使IL-1β表達量升高，但差異不顯著（P＞0.05）；BA預(yù)處理使IL-6表達量呈劑量依賴式上升（P＜0.01）；0.50 mg/kg mb和1.00 mg/kg mbBA使TNF-α的表達量極顯著下降（P＜0.01），但0.25 mg/kg mbBA預(yù)處理使肝臟TNF-α的表達量極顯著上升（P＜0.01）；BA預(yù)處理均能提高IL-10 mRNA的相對表達量，以0.50 mg/kg mbBA組差異極顯著（P＜0.01）。

圖5 BA對CYP致小鼠肝臟IL-1β（A）、IL-6（B）、IL-10（C）和TNF-α（D） mRNA表達的影響Fig. 5 Effect of BA on the mRNA expression of IL-1β (A), IL-6 (B),IL-10 (C) and TNF-α (D) in liver tissues of CYP-induced mice

3 討 論

CYP作為氮芥類烷化劑，其抗癌譜廣，廣泛用于治療各種癌癥，因其胃腸道和肝臟等毒性作用臨床應(yīng)用受到限制。高劑量CYP可引起急性肝毒性效應(yīng)，其特征是通過肝臟產(chǎn)生炎性細胞因子和自由基來誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)和氧化應(yīng)激。CYP可誘導(dǎo)肝細胞抗氧化能力下降，引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝細胞受損，表現(xiàn)為肝功能指標(biāo)ALT、AST和膽紅素的增加以及血清白蛋白濃度的降低等[19]，血清酶活力急劇升高表明肝臟中的細胞損傷和細胞膜功能完整性的喪失。本實驗結(jié)果顯示，CYP引起了肝臟中AST和ALT水平的上升，并且從病理切片中可以看出CYP引起肝細胞出現(xiàn)大量空泡，說明CYP造成了肝損傷，破壞肝細胞細胞膜的完整性；而用BA預(yù)處理后，能夠下調(diào)由CYP引起的小鼠肝指數(shù)的上升以及血清酶活力的升高，說明BA通過具有潛在的修復(fù)細胞膜的穩(wěn)定性，改善肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而緩解CYP引起的肝臟損傷。

CYP在肝臟中經(jīng)細胞色素P450氧化酶參與生物轉(zhuǎn)化，形成具有高度毒性的代謝物——丙烯醛和磷酰胺，丙烯醛與GSH結(jié)合，干擾組織抗氧化防御系統(tǒng)，并誘導(dǎo)活性氧的過量生成，活性氧攻擊細胞膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA等物質(zhì)[20]。本實驗中，CYP組肝臟MDA含量升高，與Mahmoud等[21]的結(jié)果相似，說明CYP誘導(dǎo)產(chǎn)生肝臟的氧化損傷；用BA預(yù)處理后MDA含量下降，說明BA通過減少脂質(zhì)過氧化，緩解機體的氧化損傷。CAT、SOD、GSH和GSH-Px作為抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，通過與其他酶協(xié)同完成細胞內(nèi)的抗氧化作用。CAT主要存在于組織細胞的微粒體內(nèi)，清除體內(nèi)的羥自由基，催化H2O2的分解；SOD清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受氧化損傷；而GSH-Px則主要通過催化GSH的活力，還原狀態(tài)的GSH直接與活性氧自由基結(jié)合反應(yīng)，從而清除體內(nèi)的氧自由基，保護細胞免受有毒物質(zhì)及氧化物的攻擊[22]。Alqahtani等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CYP引起小鼠肝臟CAT、SOD和GSH-Px的活力及GSH含量降低，誘導(dǎo)氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，CYP組CAT活力降低，說明CYP引起肝臟氧化應(yīng)激；但SOD、GSH和GSH-Px水平升高，可能是CYP誘導(dǎo)的急性損傷引起的機體代償性反應(yīng)，刺激了SOD、GSH和GSH-Px的過度分泌，維持了機體氧化系統(tǒng)的平衡。據(jù)研究報道，頭頸部癌癥患者組織中GSH含量升高，但血液中GSH含量降低[23]。乳腺癌患者血液和組織中GSH含量隨著疾病的發(fā)展而降低[24]?；诖?，認為氧化應(yīng)激引起初期組織損傷，GSH被谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶快速降解，以抵抗氧化應(yīng)激引起的損傷，機體捕獲到相關(guān)信號后，誘導(dǎo)組織中GSH快速合成和釋放，來適應(yīng)環(huán)境的變化；隨著疾病的發(fā)展和組織的進一步損傷，GSH的消耗率高于合成率。因此，在氧化應(yīng)激引起組織損傷的早期，損傷組織中GSH的水平高于正常組織[25]。BA預(yù)處理后，肝組織中CAT的活力以及0.25、1.00 mg/kg mbBA組GSH含量繼續(xù)升高，說明BA通過增強抗氧化酶的活力，對CYP致肝臟氧化損傷起到預(yù)防性保護作用。但是BA預(yù)處理后，SOD活力出現(xiàn)下降趨勢，說明BA通過恢復(fù)SOD活力和GSH的水平，改變氧化狀態(tài)，維持氧化還原系統(tǒng)的穩(wěn)定。有趣的是0.50 mg/kg mbBA組GSH水平出現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為藥物在體內(nèi)的效果是呈現(xiàn)U形趨勢，即在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的升高，藥效也升高，當(dāng)達到最高藥效時，繼續(xù)增加藥物的濃度會引起相反的結(jié)果，也就是說藥物是有合適的濃度范圍，過高或者過低可能會導(dǎo)致不良的結(jié)果[26]。因此，在本研究中，0.50 mg/kg mb的BA緩解了由CYP引起的GSH水平的上升。以上結(jié)果說明BA通過清除自由基和抗氧化特性對CYP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和肝臟損傷起保護作用。

氧化應(yīng)激參與多種生理過程，尤其是在炎癥應(yīng)答中發(fā)揮類似“第二信使”的作用。越來越多的研究表明，炎性細胞因子是炎癥反應(yīng)的生理信使分子[27]。炎癥包括炎癥細胞的激活，促炎因子的分泌，以及不同炎癥介質(zhì)的釋放，其中IL-1β、IL-6和TNF-α作為促炎因子，是研究炎癥反應(yīng)的重要細胞因子。已有研究證明，CYP誘導(dǎo)促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌，抑制抗炎因子IL-10水平升高，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[28-29]；研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射CYP，刺激肝臟IL-1β和TNF-α mRNA表達增加，抑制IL-10 mRNA表達，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。BA預(yù)處理緩解了CYP致肝臟IL-1β、TNF-α mRNA表達升高，降低IL-10 mRNA表達，Ajala-Lawal[30]和Li Nan[31]等研究發(fā)現(xiàn)，BA引起血液中IL-1β和成纖維滑膜細胞TNF-α mRNA的表達量下降；BA可恢復(fù)IL-10的表達量對腎臟起到預(yù)保護作用[32]，這說明BA通過抑制促炎因子的分泌，促進抗炎因子的分泌，對CYP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起到預(yù)防性保護作用。雖然大量的動物實驗顯示CYP具有促炎效果[33-35]，但有研究發(fā)現(xiàn)，CYP能抑制TNF-α和IL-12的分泌或者對IL-6、IL-10、TNF-α分泌沒有影響[36-37]，還有研究發(fā)現(xiàn)，CYP既能促進又能降低機體IL-6、IL-10、IFN-g和IL-1β水平[38-39]。CYP這種矛盾的現(xiàn)象可能是由于其對細胞因子產(chǎn)生的影響主要依賴于產(chǎn)生細胞因子和刺激的細胞，也有可能是幾條通路共同參與了這一過程。本實驗中，CYP使小鼠肝臟IL-6 mRNA表達水平顯著降低，這可能是抑制促炎反應(yīng)的對抗機制的一部分，CYP的促炎反應(yīng)最終會引起代償性抗炎反應(yīng)。在BA預(yù)處理后緩解CYP致肝臟IL-6表達水平下降，此結(jié)果與Wang Xihong[25]報道一致。據(jù)研究報道，IL-6在大腦損傷后8～18 h內(nèi)達到最高水平，而TNF-α在3～8 h達到最高水平，說明在代償性反應(yīng)中，細胞因子的改變與時間呈現(xiàn)一定的關(guān)系[40]，出現(xiàn)IL-6、IL-1β和TNF-α表達量不同步情況。所以，在本研究BA引起IL-6 mRNA的表達呈相反趨勢，并且不同劑量的BA對IL-1β和TNF-α mRNA表達水平的影響不同。綜上所述說明BA能調(diào)控炎性因子的平衡對肝臟炎癥損傷起到預(yù)防性保護作用。