外源褪黑素處理對鮮切芒果貯藏品質的影響

劉帥民，胡康琦，劉港帥，張善英，潘永貴，史學群，張正科,*

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南 ?？?570228；2.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

芒果（Mangifera indicaL.）是一種具有極高營養(yǎng)價值的熱帶水果，因富含碳水化合物、礦物質、膳食纖維、維生素和多酚等成分而深受大眾喜愛[1-2]。經過分級、清洗、去皮、去核、切塊或切片、包裝等處理以得到方便即食的水果或蔬菜稱為鮮切果蔬[3]，鮮切加工的芒果由于其新鮮、方便快捷、可食率高等特點，日益受到國內外消費者青睞。然而，鮮切容易造成果肉組織代謝過程發(fā)生紊亂，進而造成果肉發(fā)生褐變以及腐敗變質[4]；因此急需探尋適宜的保鮮方式以延長鮮切芒果的貨架期。目前，國內外有關維持鮮切芒果品質的研究主要集中在控制采收期和成熟度[5]、熱處理[6-7]、可食性涂膜[8]、果蔬保鮮劑[4,7,9-10]、脈沖光處理[9,11]等應用技術方面。其中，采用安全性較高的保鮮劑是最為常見的鮮切芒果保鮮方法之一。目前已有檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、鈣鹽等在鮮切芒果中的應用報道，但是仍存在保鮮效果不穩(wěn)定、易改變果實風味等問題。

褪黑素（N-乙?；?5-甲氧基色胺）是一種具有較強生物活性的天然物質，廣泛存在于動植物體中[12]。在高等植物中，褪黑素被證實是一種類似于植物激素的信號分子，參與多個生理過程的調控，例如種子萌發(fā)、開花、晝夜節(jié)律、光合作用、成熟和衰老以及對環(huán)境脅迫的響應等[13]。近年來，褪黑素在果蔬采后貯藏保鮮方面的應用受到了廣泛關注。用褪黑素處理采后桃果實可抑制其質量損失及呼吸作用，增強果實抗氧化活性，從而有效減緩果實品質下降[14]；褪黑素還可通過增強抗氧化活性和提高氧化損傷修復能力來延緩采后荔枝果實在貯藏期間的快速褐變，延長其貨架期[15]；褪黑素處理可增加草莓果實總酚（total phenolics，TP）和類黃酮含量，繼而提高果實抗氧化能力，維持其較好的貯藏品質[16]；此外，褪黑素處理還可抑制采后香蕉[17]和梨[18]果實在貯藏期間的乙烯生物合成，故能延緩果實的成熟衰老及品質劣變。這些研究表明，褪黑素作為一種新型、天然、安全的保鮮劑，能夠有效維持果蔬的采后品質，具有較好的應用前景。然而，將褪黑素應用于鮮切芒果的保鮮研究尚鮮見報道。

本實驗研究了外源褪黑素噴灑處理對鮮切芒果貯藏過程中品質變化的影響，旨在明確褪黑素對鮮切芒果的作用效果及其相關生理機制，為褪黑素在鮮切水果中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘貴妃’芒果采摘于三亞崖州（109°18′E、18°33′N），果實運抵實驗室后進行分級和清洗，自然晾干后選擇顏色、形狀、大小一致的果實置于室溫條件（（20±1）℃、相對濕度（85±5）%）貯藏，待果實成熟至可食用期后進行切分。

褪黑素（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；β-胡蘿卜素、抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、乙腈、甲醇、四氫呋喃 上海阿拉丁試劑有限公司；沒食子酸、蘆丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、檸檬酸 北京索萊寶科技有限公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FT-02型硬度計 意大利Breuzzi公司；手持式折射儀 日本Atago公司；CR-400色差儀 日本Konica Minolta公司；T18數字高速均質機 德國IKA集團；CR22N落地式高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；1260高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC） 美國安捷倫科技有限公司；T6新世紀紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將達到可食用期的芒果（硬度25 N、可溶性固形物質量分數（soluble solid content，SSC）13%、總可滴定酸（total titratable acidity，TTA）質量分數0.3%左右）隨機分成2 組，每組99 個。將果實削皮后切塊，并將每3 個果實的12 個切塊（從每個芒果切出的切塊中選擇4 塊2 cm×2 cm×2 cm的切塊）分裝在一個一次性聚丙烯保鮮盒（135 mm×90 mm×40 mm，塑料盒上含16 個直徑6 mm的小孔）中，每盒果實代表1 個生物學重復。將褪黑素溶解于蒸餾水配制成濃度為0.5 mmol/L的溶液（該濃度經預實驗篩選獲得）。在每個芒果塊上均勻噴灑褪黑素溶液，對照組噴灑相同量的蒸餾水，自然晾干后置于（15±1）℃、相對濕度（85±5）%條件下貯藏4 d。貯藏期間，每日各取3 盒處理組和對照組的果實切塊進行果肉色澤、硬度、SSC、TTA質量分數和固酸比測定。與此同時，每日各取3 盒處理組和對照組的果實切塊進行果肉取樣，用液氮快速冷凍、搗碎，貯存在-40 ℃冰箱中待測其他生化指標。

1.3.2 感官品質指標測定

使用色差儀進行果肉顏色測定，數值基于CIE系統(tǒng)以L*、a*、b*值表示，其中L*值表示亮度、a*值代表紅/綠度、b*值代表藍/黃度。

使用FT-02型硬度計（探頭直徑為6 mm）測定硬度。對于SSC測量，取10 g果肉組織勻漿，在8 000×g 條件下離心15 min，上清液用手持折射儀測定其SSC，單位為%。將上述上清液（2 mL）用18 mL蒸餾水稀釋，然后用0.01 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.1，TTA質量分數以芒果中的檸檬酸質量分數表示。固酸比為SSC與TA的比值。

1.3.3 營養(yǎng)品質指標測定

β-胡蘿卜素含量測定參照Shivashankara等[19]的方法并略作修改。通過HPLC進行分析，配備分析柱Zorbax SB-Aq-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣量10 μL，流動相為甲醇和乙酸乙酯（5 0∶5 0，V/V），平衡10 min，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃。通過可變波長掃描紫外檢測器在449 nm波長處測定吸光度，β-胡蘿卜素含量通過標準品繪制的標準曲線進行計算，單位為mg/kg，結果以鮮質量計。

AsA含量測定參照Gonzalez-Aguilar等[20]的方法并略作修改，將果肉組織（2 g）于100 mL含30 g/L的偏磷酸和80 mL/L的乙酸溶液中勻漿。將勻漿在8 750×g、4 ℃條件下離心15 min，之后將上清液通過0.22 μm膜過濾器并注入高效液相色譜儀。檢測波長為245 nm，進樣量10 μL，流速為1.0 mL/min；使用Zorbax SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為固定相，流動相為體積分數0.25%的偏磷酸溶液（pH 2.55）。AsA含量的單位為mg/kg，結果以鮮質量計。

1.3.4 TP和類黃酮含量測定

TP含量測定采用福林-酚法[21]。用沒食子酸制作標準曲線，單位為mg/kg。類黃酮提取和測定參照林毅雄等[22]的方法。用蘆丁繪制標準曲線計算類黃酮類含量，類黃酮含量表示為mg/kg。以上結果均以鮮質量計。

1.3.5 多酚氧化酶和過氧化物酶活力測定

按照Zhang Zhengke等[23]的方法，取5 g果肉組織于40 mL 50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（含5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），pH 7.0）中勻漿得到酶提取液。測定多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活力時，分別以1 mL 0.5 mol/L鄰苯二酚和1 mL 0.5 mol/L愈創(chuàng)木酚為底物，加入0.5 mL酶提取液啟動反應后分別在420、470 nm波長處分別測定吸光度。以每毫克蛋白每分鐘吸光度變化0.01為1 個酶活力單位（U），PPO和POD活力均表示為U/mg。

1.3.6 O2-·產生速率和·OH產生量測定

冷凍果肉（2 g）加入10 mL 65 mmol/L PBS（pH 6.8）勻漿，之后將勻漿液在4 ℃、5 000×g離心15 min，得到上清液，取上清液測定O2-·產生速率和·OH產生量。O2-·產生速率測定采用Gao Hui等[14]的方法，用NaNO2制作標準曲線，O2-·產生速率以每千克鮮果肉每分鐘產生的NaNO2質量表示，單位為nmol/（g·min）?！H產生量測定參照張乃東等[24]的方法，取上清液1 mL，轉移至含有1 mL 0.025 mol/L的[F e（p h e n）3]2-（1.4 8 5 g 一水合鄰菲啰啉、0.695 g FeSO4·7H2O溶于100 mL蒸餾水中配制而成）和1 mL蒸餾水的試管中。以蒸餾水調零，測定溶液在420 nm波長處的吸光度（A1），以蒸餾水代替上清液測定的吸光度為A0?！H產生量以ΔA表征，其中ΔA＝A0-A1。

1.3.7 總抗氧化活性測定

取2 g果肉在20 mL含有0.5 g/L的偏亞硫酸氫鈉的甲醇中勻漿，之后在4 ℃、4 000×g條件下離心20 min制備甲醇提取液。

參照Zhang Zhengke等[23]的方法測定總抗氧化活性，將1 mL甲醇提取液與3 mL含0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液混勻后在25 ℃條件下于黑暗中孵育30 min，在517 nm波長處測定樣品吸光度。對照以甲醇代替甲醇提取液、空白以甲醇代替DPPH溶液測定吸光度。DPPH自由基清除率按下式進行計算。

還原力測定根據Fan Panhui等[25]的方法，將0.2 mL上述甲醇提取物與2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 6.6）混合，然后加入2.5 mL 1 g/L鐵氰化鉀溶液反應，之后將3 mL反應液以蒸餾水做空白在700 nm波長處測定吸光度，記錄為A0，以甲醇代替甲醇提取液在同等反應條件下測定吸光度，記錄為A1，還原力用ΔA表征，其中ΔA＝A0-A1表示。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

用SPSS軟件對數據進行單因素方差分析，比較處理組與對照組差異的顯著性。用Sigmaplot 14.0軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 褪黑素對鮮切芒果感官品質的影響

圖1 褪黑素處理對鮮切芒果果肉色澤的影響Fig. 1 Effect of melatonin treatment on the color of fresh cut mango pulp

由圖1可知，在整個貯藏期間，對照組和褪黑素處理組果肉色度L*值和b*值持續(xù)下降，a*值則呈現不斷上升趨勢。L*值可以直觀地反映果實在貯藏過程中果肉的光澤度[26]。從第1天開始，對照組果肉L*值顯著或極顯著低于處理組（圖1A），說明褪黑素處理可以抑制果肉光澤度的下降。a*值增加代表果實顏色由綠轉紅，由于早期果肉中存在部分葉綠素未被分解，使果肉呈現一定的綠色，褪黑素處理顯著抑制了a*值的上升（圖1B），說明褪黑素對衰老過程中的葉綠素降解有延緩作用，這與褪黑素處理采后菜心所獲得的結果[27]相似。β-胡蘿卜素是芒果的主要色素成分，使芒果呈現黃色或橙黃色[28]。b*值代表果肉中黃色比重，由圖1C可以觀察到，對照組b*值快速下降，褪黑素處理顯著抑制了b*值下降，這說明褪黑素處理延緩了鮮切芒果貯藏期間β-胡蘿卜素的損失，維持了果肉的色澤。

圖2 褪黑素處理對鮮切芒果硬度（A）、SSC（B）、TTA質量分數（C）和固酸比（D）的影響Fig. 2 Effect of melatonin treatment on the firmness (A), SSC (B), TTA content (C) and ratio of SSC to TTA (D) of fresh-cut mango pulp

果肉硬度、SSC和TTA質量分數是芒果重要的感官與風味指標[29]。隨著貯藏時間延長，處理組和對照組果肉硬度都呈下降趨勢，但相比于對照組，褪黑素處理能顯著抑制鮮切芒果貯藏期間硬度的下降（圖2A）。此結果與褪黑素處理桃[14]、草莓[16]、香蕉[17]和梨[18]等果實所獲得的結果相一致。研究表明，細胞壁組分降解是果實硬度下降的最主要原因，而鮮切加工所導致的機械損傷可促使活性氧（reactive oxygen species，ROS）迸發(fā)，其通過非酶促方式攻擊果實細胞壁，進而造成細胞壁發(fā)生降解[30]。褪黑素作為一種ROS清除劑，能夠有效清除植物細胞中過量生成的ROS，進而抑制細胞壁降解和果實軟化[12]。

SSC和TTA質量分數能分別反映果實的甜度和酸度。如圖2B所示，褪黑素處理顯著抑制了芒果貯藏期間的SSC下降，且差異達到顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）水平。如圖2C所示，鮮切芒果的起始TTA質量分數為0.28%。在貯藏期間，TTA質量分數在對照組和褪黑素處理組鮮切芒果中都迅速下降，而褪黑素處理顯著抑制了TTA質量分數降低（P＜0.05）。結果表明，褪黑素能有效維持果實的風味。有研究發(fā)現用蘋果酸[8]和有機酸[31]等抗氧化劑處理鮮切芒果后，其對SSC和TTA質量分數的影響與本實驗的結論相似。固酸比是決定果實口感和風味的重要評價指標[11,29,32]，本研究中，褪黑素處理有效延緩了固酸比的上升，這在一定程度上保留了鮮切芒果風味。

2.2 褪黑素對鮮切芒果營養(yǎng)品質的影響

圖3 褪黑素處理對鮮切芒果β-胡蘿卜素（A）和AsA（B）含量的影響Fig. 3 Effect of melatonin treatment on β-carotene (A) and ascorbic acid (B) contents in fresh-cut mango pulp

芒果含有豐富的抗壞血酸、β-胡蘿卜素、酚類化合物和α-生育酚等抗氧化物質[20]。由圖3可知，在貯藏期間，褪黑素處理組和對照組β-胡蘿卜素含量呈先上升后下降的趨勢，在貯藏的第2、3天，褪黑素處理組的β-胡蘿卜素含量顯著高于對照組。鮮切水果由于切面暴露于氧氣、微生物、光等逆境脅迫條件下，促使β-胡蘿卜素、酚類化合物被氧化，導致這些物質的結構和生物活性發(fā)生不可避免的變化。本實驗表明褪黑素處理可以減緩β-胡蘿卜素分解，使鮮切芒果的營養(yǎng)品質得以較好的保持，這一結果在Marchetti等[33]的研究中也被證實，其通過用褪黑素處理在γ射線輻照下的脂質體，發(fā)現褪黑素對低密度脂蛋白中的α-生育酚和β-胡蘿卜素都有保護作用。在整個貯藏期內，褪黑素處理組和對照組果肉的AsA含量都呈先上升后下降的趨勢，然而從貯藏第2天起，褪黑素處理組果肉AsA含量顯著高于對照組（圖3B）。研究結果表明，褪黑素處理降低了鮮切芒果果肉在貯藏期間AsA的損失，并在一定程度上維持了鮮切芒果的非酶抗氧化能力，這一結果與Liu Changhong等[16]用褪黑素處理草莓的結果相同。

2.3 褪黑素對鮮切芒果TP和類黃酮含量的影響

圖4 褪黑素處理對鮮切芒果TP（A）和類黃酮（B）含量的影響Fig. 4 Effect of melatonin treatment on total phenolics (A)and flavonoids (B) contents in fresh-cut mango pulp

果肉中較高的酚含量與果實抗氧化活性密切相關。TP含量在整個貯藏期間呈不斷下降的趨勢，對照組的TP含量從貯藏第0天的472.34 mg/kg逐漸降低至貯藏結束時的91.29 mg/kg。整個貯藏期間，褪黑素處理的鮮切芒果中TP含量顯著或極顯著高于對照組（圖4A）。類黃酮屬酚類化合物，是植物的次生代謝產物之一[22]。如圖4B所示，類黃酮含量在整個貯藏期間呈下降趨勢，但褪黑素處理顯著抑制了鮮切芒果類黃酮含量下降。結果表明，褪黑素處理能有效減少鮮切芒果在貯藏期間TP和類黃酮損失，進而維持了鮮切芒果的抗氧化活性與營養(yǎng)品質。

2.4 褪黑素處理對鮮切芒果PPO、POD活力的影響

果蔬發(fā)生酶促褐變是酚類物質發(fā)生氧化的直接結果，酚類物質在有氧條件下被PPO催化氧化為醌類物質后，醌類物質通過非酶聚合反應生成有色物質從而導致果蔬組織褐變[34]。由于鮮切加工不可避免地會造成果蔬細胞膜破壞，酚類物質與PPO和POD充分接觸而發(fā)生酶促褐變。由圖5可見，本研究中，對照組PPO、POD活力一直處于較高水平，直至貯藏結束，果實生物學代謝出現崩潰特征，PPO、POD活力出現下降。褪黑素處理使鮮切芒果PPO、POD活力在貯藏期間（除第4天外）一直處于較低水平，表明其能夠有效抑制鮮切芒果發(fā)生酶促褐變，使處理組直至貯藏結束仍保持較高感官品質。此外，褪黑素處理可維持較高的AsA含量（圖3B），而AsA可對酶促反應形成的鄰醌的前體二酚進行還原，從而降低PPO活力，繼而抑制褐變[32]。褪黑素通過抑制PPO和POD活力來延緩酶促褐變也在荔枝果實中也得到了證實[15]。

圖5 褪黑素處理對鮮切芒果PPO（A）和POD（B）活力的影響Fig. 5 Effect of melatonin treatment on the activity of PPO (A)and POD (B) in fresh-cut mango pulp

2.5 褪黑素處理對ROS生成的影響

圖6 褪黑素處理對鮮切芒果·（A）和·OH（B）生成的影響Fig. 6 Effect of melatonin treatment on the production of O－2· (A)and ·OH (B) in fresh-cut mango pulp

2.6 褪黑素處理對總抗氧化活性的影響

圖7 褪黑素處理對鮮切芒果DPPH自由基清除率（A）和還原力（B）的影響Fig. 7 Effect of melatonin treatment on DPPH free radical-scavenging capacity (A) and reducing power (B) in fresh-cut mango pulp

由圖7可知，在整個貯藏期間，DPPH自由基清除能力和還原力都呈不斷下降趨勢，但從貯藏的第1天起，褪黑素處理鮮切芒果的DPPH自由基清除能力和還原力均顯著或極顯著高于對照組。DPPH自由基清除能力和還原力可用來評價非酶抗氧化活性，其與TP、類胡蘿卜素、抗壞血酸、生育酚等抗氧化物質含量有關[37]。本研究中，褪黑素處理能抑制鮮切芒果TP、β-胡蘿卜素、AsA含量的下降，表明褪黑素能夠有效維持總抗氧化活性，進而能夠延緩鮮切芒果的品質下降，這與Zhang Yueying[15]和Liu Changhong[16]等用褪黑素處理荔枝和草莓獲得的結果相似。

3 結 論

本研究結果表明，褪黑素（0.5 mmol/L）處理鮮切芒果可以有效維持果肉色澤和硬度，減少可溶性固形物和TTA的損失。同時，褪黑素處理延緩了鮮切芒果β-胡蘿卜素、AsA、TP和類黃酮含量下降并抑制了鮮切芒果果肉中POD和PPO活力，從而延緩了鮮切芒果果肉褐變并維持其營養(yǎng)品質。此外，褪黑素處理降低了鮮切芒果中O2-·和·OH的生成并維持了DPPH自由基清除能力與還原力，導致果實抗氧化能力得到提高。以上研究表明褪黑素處理可有效維持鮮切芒果的貯藏品質。