外泌體提取及其在糖尿病腎病診治中的研究進(jìn)展

（湖南省衡陽市南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南衡陽 421000）

0.引言

糖尿病是威脅著人類生命健康的主要疾病之一[1]。糖尿病患者在終末期會出現(xiàn)嚴(yán)重的腎衰竭，其主要原因來自糖尿病腎病，糖尿病腎病早期診斷，能夠影響患者的治療以及預(yù)后[2-3]。外泌體最初在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中被發(fā)現(xiàn)，其來源于晚期內(nèi)吞體囊泡，在尿液、唾液、腹水以及羊水等體液中，通過投射電子顯微鏡均可檢測到，其直徑約為30nm～100nm，形狀為雙圓盤狀或者杯口狀，粒徑范圍在不同的部位中呈現(xiàn)不同的數(shù)值，這些囊泡在最初被認(rèn)為是細(xì)胞產(chǎn)生的垃圾，后來研究發(fā)現(xiàn)外泌體包含各種信號分子，能夠加入機(jī)體免疫，細(xì)胞遷移等過程[4-5]。細(xì)胞之間主要通過外泌體進(jìn)行交流，研究表明，正常細(xì)胞和病變細(xì)胞分泌出來的外泌體呈現(xiàn)出不同的負(fù)載信號分子，能夠影響疾病診斷以及治療[6]。本文以糖尿病腎病患者為例，探討外泌體提取及其在糖尿病腎病診治中的研究進(jìn)展。

1.外泌體的提取方法

為了能夠充分的研究外泌體的功能，需將其從尿液、血液以及細(xì)胞上清液當(dāng)中提取出來，當(dāng)前外泌體分離的技術(shù)有很多，并衍生出多種提取試劑盒，但能夠?qū)ν饷隗w的純度、含量以及生物活性進(jìn)行同時(shí)監(jiān)測尚無具體方法[7-8]。

隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，人們在外泌體提取的過程中，逐漸總結(jié)了多種方法，主要包括：超速離心法、超濾離心法、凝膠排阻色譜法、聚合物沉淀法、免疫磁珠法以及微流體系法[9]。

外泌體提取的常規(guī)方式為超速離心法，是檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法操作較簡單，能夠得到較多的外泌體量，但其耗時(shí)長，提取的純度低，極有可能改變外泌體的大小結(jié)構(gòu)[10]。超濾離心法在操作上較為簡單，且用時(shí)較短，在過濾的過程中，極易造成外泌體的變形甚至囊泡碎碎，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成嚴(yán)重影響[11]。凝膠排阻色譜法是簡單有效的外泌體提取方法，能夠完整的保存外泌體的生物活性以及完整度，但該操作對設(shè)備要求較嚴(yán)格，所需的時(shí)間較長，故不能廣泛應(yīng)用[12]。目前，微流體系統(tǒng)用來提取外泌體的方法越來越受到人們的青睞，該方式能夠提取到高純度的外泌體，并且，能夠及時(shí)地應(yīng)用于疾病檢測。一些科學(xué)家聯(lián)合生產(chǎn)的柱形微流控芯片具有極高的靈敏度，能夠分開20nm～110nm的顆粒[13]。2017年，有研究人員提出了新的微流體裝置，即在人體血液中捕獲和釋放外泌體，相對于常規(guī)試劑盒，改方法具有更優(yōu)質(zhì)的性能。外泌體提取在中國也取得了長足穩(wěn)定的進(jìn)步，劉筆鋒教授（華中科技大學(xué)）研制出了一種微流體芯片，利用特別拓?fù)浼{米材料和識別分子提高了外泌體的提取效率[14]。近期提出了更為高效的提取方式，即通過連續(xù)以及無標(biāo)記的方法，從細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行外泌體提取，達(dá)到了外泌體提取量和回收率共同提高的目標(biāo)[15]。除此之外，來自美國的研究人員通過脂質(zhì)分子探針對胞外囊泡進(jìn)行分離，整個(gè)過程在15min全部完成，極大地提高了分離速度，且與超高速離心法效率比較，其囊泡成分接近甚至更具優(yōu)越性[16]。同時(shí)該方法與RNA表達(dá)以及DNA突變分析等后續(xù)分子檢測技術(shù)相連接。

2.在糖尿病腎病（DN）的生物標(biāo)志物

檢測DN的主要方式是通過尿液檢測，其主要標(biāo)志是尿液總蛋白、miRNA。外泌體具有雙層膜結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，能夠隔離RNA酶與其他內(nèi)容物，能夠?qū)δ讣?xì)胞進(jìn)行保護(hù)，使其降解作用降低，能夠?qū)⒛讣?xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)充分展示出來，并清晰反應(yīng)其功能，在準(zhǔn)確診斷DN方面，尿外泌體miRNA檢測相較于上述標(biāo)志具有更大優(yōu)勢[17]。

2.1 來源蛋白

Gudehithlu的研究表明，相較于全尿分析，外泌體蛋白標(biāo)志物在DN患者的腎潛在的蛋白變化中，體現(xiàn)的更加準(zhǔn)確，能夠以此檢測DN患者的疾病發(fā)展情況。研究人員曾對130例II型糖尿病患者展開研究，其尿外泌體亮氨酸氨基肽酶以及二肽基肽酶4同DN的發(fā)展程度存在正比關(guān)系[18]。有研究指出，通過檢測I型DN患者不同病程的尿液發(fā)現(xiàn)，其中多種蛋白酶和蛋白酶抑制劑表達(dá)水平出現(xiàn)了明顯的改變。Lou等做出相關(guān)研究指出，DN病情的發(fā)展影響著尿微泡結(jié)合素，能夠作為ND檢測和檢測其發(fā)展情況。

2.2 miRNA

外泌體來源miRNA是參與各種生理過程的重要信號分子，在Barutta的研究中指出，糖尿病患者以及微白蛋白尿患者的外泌體miRNA-145以及miRNA-130a水平高于白蛋白尿正?；颊?。其他相關(guān)研究表明，miRNA-192在微量蛋白尿組表達(dá)水平顯著增長，但在大量白蛋白尿組呈降低模式，辨明其直接影響著DN的檢測，成為DN早期患者的重要生物標(biāo)志[19]。

3.外泌體作為藥物載體的研究進(jìn)展

外泌體能夠作為載體對基因、抗原以及蛋白等種類的藥物進(jìn)行研究，為腫瘤和感染類疾病的研究做出了重要的貢獻(xiàn)。藥物承載外泌體的主要方式是將母細(xì)胞與載體實(shí)行共混培養(yǎng)，或者將母細(xì)胞實(shí)行化學(xué)轉(zhuǎn)染，使母細(xì)胞的外泌體含有足夠藥量，但其轉(zhuǎn)染無法達(dá)到較高的效率，同時(shí)不能得到較高的基因表達(dá)，具有相對明顯的劣勢。除此之外，電穿法、皂化法以及超聲法等。

迄今為止，對外泌體應(yīng)用在DN疾病的治療方面的研究較少，但其在其他方面的研究已經(jīng)初見成效，在對DN的治療起到了指導(dǎo)作用[20]。來自墨爾本大學(xué)的研究表明，外源蛋白能夠通過晚期結(jié)構(gòu)域來加載至外泌體中，然后向小鼠腦內(nèi)輸入外源蛋白（具有生物活性），結(jié)果表明，在部分腦區(qū)域中出現(xiàn)了異常情況，一些被裝入蛋白的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)到受體神經(jīng)元。微流體芯片的設(shè)計(jì)從根本上增加了外泌體的分離效率[21]。

外泌體已逐漸應(yīng)用于治療糖尿病的部分疾病。報(bào)道指出，外泌體能夠阻止糖尿病腎并發(fā)癥的發(fā)生。外泌體已經(jīng)逐漸成為醫(yī)學(xué)界研究的重要內(nèi)容，腎細(xì)胞外泌體嚴(yán)重影響著人類的生命健康，尿外泌體作為腎細(xì)胞外泌體的重要部分，成為了多種疾病的生物標(biāo)志物[22]。不僅能夠快速診斷疾病，而且在腫瘤發(fā)展的檢測中，起到了重要的作用，除此之外，其還主要作用于評估疾病的治療效果，預(yù)防術(shù)后的并發(fā)癥，為人類的健康做出極大貢獻(xiàn)。隨著科技水平的不斷進(jìn)步，外泌體將會以新的姿態(tài)為DN患者的治療和預(yù)后做出更多的貢獻(xiàn)。

4.結(jié)語

提取外泌體的方式很多，但目前尚未發(fā)現(xiàn)一種方式能夠在保證含量的同時(shí)，達(dá)到純度高和保證生物活性的優(yōu)勢。目前，外泌體生物學(xué)標(biāo)志物在DN中的研究尚未得到廣泛發(fā)展，但在DN診斷與病情監(jiān)測方面突顯出了極大優(yōu)勢。雖然有關(guān)于在DN藥物中應(yīng)用外泌體作為載體的研究較少，但在相關(guān)疾病的治療過程中，作為藥物傳遞系統(tǒng)，具有巨大的研究前景。