黃小瓊,鄭玉連,曾育培,鄭佳琳,武 昕,饒子亮,王 諾,嚴家榮,鄺少松

（廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，佛山528248）

進行動物實驗前需要對實驗動物進行編號標記分組，這是一個重要的準備工作，對后期跟蹤記錄實驗動物是很有必要的，但對動物編號標記的同時應(yīng)保證編號不對動物生理或者實驗產(chǎn)生影響，而且號碼要清楚易認、耐久、便捷、適用，目前常用的方法主要有染色法、耳孔法、剪趾法[1]，另外還有目前市售的紋尾法、芯片法。之前常用的苦味酸染色法，比較方便適用、耐久，但苦味酸（2,4,6 三硝基苯酚）是炸藥的一種成分，目前國家已經(jīng)明文限制使用。以上各種標記方法均有優(yōu)缺點，未能達到滿意的效果，本文作者經(jīng)過大量的篩選、分析比較，得出單色溴甲酚綠溶液對小鼠染色編號標記法比較符合編號各種要求，效果滿意，從而為實驗動物編號提供新的途徑方法。

1 材料與方法

1.1 動物分組與飼養(yǎng) SPF 級雌雄各半NIH 小鼠44 只，18～22 g，，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證明編號：44007200064561。SCXK（粵）2018-0002]。飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[SYXK（粵）2018-0002]。分成6 組：0.5%中性品紅標記組、2%硝酸銀液標記組、0.5%甲紫溶液標記組和2.5%溴甲酚綠液標記組各6 只，2.5%溴甲酚綠液染毒組20 只，動物實驗經(jīng)中心實驗動物倫理委員會審查批準。

1.2 主要儀器和試劑 JEA3001 型電子天平，d=0.1 g，上海浦春計量儀器有限公司；90-1B 磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司。溴甲酚綠：批號：20170502；天津市天新精細化工開發(fā)中心；

1.3 染色液標記篩選 分別用0.5%中性品紅、2%硝酸銀液、0.5%甲基紫溶液和2.5%溴甲酚綠液(2.5g 溴甲酚綠加50%酒精定容至100mL)涂染相應(yīng)組別的實驗動物不同部位，涂染順序從左到右、從前到后，左頭部為1 號，左前肢為2 號、左腹部為3 號，左后肢為6 號，左側(cè)為個位數(shù)，右側(cè)為十位數(shù)，左右相加得到相應(yīng)的號碼，每組6 只，篩選出符合要求的染色液做小鼠經(jīng)口急性毒性試驗。

1.4 2.5%溴甲酚綠液小鼠經(jīng)口急性毒性試驗方法1.4.1 劑量設(shè)計：小鼠按20mL/kg 體重灌胃給予0.25 g/mL 供試品混懸液1 次，劑量為5000 mg/kg體重。

1.4.2 供試品配制方法：稱取2.5g 受試物，加入少量0.5%CMC-Na 溶液研磨混勻，后加入0.5%CMC-Na 溶液至10 mL，即得濃度為0.25 g/mL 的受試物混懸液10 mL。

1.4.3 染毒：動物試驗前，禁食過夜，不限制飲水。正式試驗時，染毒組動物按20mL/kg 體重灌胃給予供試品混懸液，灌胃1 次，灌胃染毒后繼續(xù)禁食約4h。

1.4.4 檢測指標 染毒后，觀察并記錄中毒作用體征出現(xiàn)和消失時間和死亡時間。觀察期為14 天。觀察期內(nèi)中毒死亡以及觀察期滿處死的動物均應(yīng)進行大體解剖，肉眼觀察，如發(fā)現(xiàn)組織或臟器出現(xiàn)異常，進一步作組織病理學(xué)檢查。分別在第0、7、14 天稱重。

1.4.5 結(jié)果判定方法 如試驗期間出現(xiàn)小鼠死亡，需降低劑量或設(shè)計多個劑量重新進行試驗；若無小鼠死亡，則認為供試品對小鼠的急性經(jīng)口LD50＞5000 mg/kg 體重。根據(jù)急性毒性分級標準[2]（表1）對供試品的毒性進行評價。

表1 急性經(jīng)口毒性的評價規(guī)定

1.5 統(tǒng)計分析 對動物體重進行統(tǒng)計處理并列表說明，原始數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標準差表示（±s）。

2 結(jié)果

2.1 染色液標記篩選 0.5%中性品紅、0.5%甲基紫溶液和2%硝酸銀液標記小鼠維持2～3d，2.5%溴甲酚綠溶液標記小鼠維持20～30d。

2.2 2.5%溴甲酚綠液小鼠經(jīng)口急性毒性試驗 20只動物在灌胃后約33min 均出現(xiàn)全身變藍，癥狀在d3 恢復(fù)。體重正常增長，未見動物死亡，LD50＞5000 mg/kg 體重。試驗結(jié)束所有動物進行大體解剖，全部動物大體解剖肉眼觀察未見異常（見表2）。

表2 溴甲酚綠對小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果（±s）

表2 溴甲酚綠對小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果（±s）

組別 劑量（mg/kg 體重） 性別 動物數(shù) 體重（g） 死亡率（%）d0 d7 d14染毒組 5000 ♂ 10 18.6±0.4 28.4±2.0 35.4±2.5 0♀ 10 18.6±0.4 24.9±1.7 28.6±1.9 0

3 討論

目前常用的實驗動物編號標記方法主要有染色法、耳孔法、剪趾法，另外還有目前市售的紋尾法、芯片法。耳標法同籠耳標容易掉落，導(dǎo)致號碼混淆、成本較高；剪趾法會造成成年動物疼痛不適，與實驗動物福利倫理不符，僅適用于新出生小鼠，市售的紋尾法、芯片法、進口標記筆法存在需要使用儀器或價格昂貴、操作不夠方便、耗時等問題。

染色編號標記法是用化學(xué)藥品在實驗動物身體明顯的部位，如被毛、四肢等處進行涂染，以染色部位、顏色不同來標記區(qū)分實驗動物，是實驗室常用、最容易掌握的方法，簡單方便，不會給實驗動物造成損傷和痛苦，但長時間實驗會使涂染劑自行褪色，或由于實驗動物互相嬉鬧、舔毛、摩擦、換毛、糞尿和飲水浸濕被毛等原因，易造成染色標記模糊不清，另外，常用染色劑的毒性對實驗動物的影響也是需要注意的問題。溴甲酚綠（3，3，5，5- 四溴間甲酚磺酰肽），是從植物中提取，灰綠色粉末，一般接觸無毒，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，主要用作酸堿指示劑，PH=3.8 時呈黃色，PH=5.4時呈藍色，PH=4.5 時開始有顏色明顯變化。廣泛用于相關(guān)酸堿指示[3～4]和血清白蛋白等臨床檢測（溴甲酚綠法）[5～6]，目前相關(guān)實驗動物毒理學(xué)研究很少。本研究溴甲酚綠標記時間較長、簡單清晰、便捷，小鼠經(jīng)口試驗評價為低毒，經(jīng)試用于豚鼠、大小鼠等效果滿意，期間可以節(jié)省動物標記操作大量時間，對動物不會造成損傷和痛苦。適用于小動物大樣本，時間稍短的實驗（慢性實驗需要中途補充加深染色），是一種經(jīng)濟有效的大樣本小實驗動物標記方法。