利拉魯肽通過下調(diào)TGF-β1和α-SMA對慢性腎功能衰竭大鼠的治療作用

陳麗 唐文莊 朱美娟 陳娟

570102 ?？冢Ｄ厢t(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液凈化科

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)定義為估算腎小球濾過率<15 mL/min·(1.73 m2)-1，其特征在于腎小球硬化，腎小管萎縮以及不可逆和進行性腎單位丟失，這與嚴(yán)重的腎臟損害和一系列代謝紊亂有關(guān)，被認(rèn)為是最常見的死亡原因之一[1-2]。血液透析或腎臟移植是治療CRF的有效策略，但是全球每年仍有近320萬患者死亡[3]。因此，迫切需要進一步闡明CRF的分子機制以尋找新的治療策略。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)作為腎小球系膜細(xì)胞增生的有效刺激劑，是導(dǎo)致纖維化過程的重要因素之一[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1的上調(diào)會導(dǎo)致CRF中腎功能的損害[6]。

α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是平滑肌細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白。據(jù)報道，腎臟中高水平的α-SMA表達是腎小管上皮-成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志[7]。此外，腎小球膜細(xì)胞活化的特征是誘導(dǎo)α-SMA表達，從而進一步促進了細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和腎小球硬化[8]。

利拉魯肽(liraglutide)是一種胰高糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)類似物，用于治療糖尿病[9]。GLP-1受體(GLP-1 receptor，GLP-1R)在腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達[10]，提示利拉魯肽可能對腎臟有保護作用。

本研究中，通過建立CRF大鼠模型研究利拉魯肽對TGF-β1和α-SMA表達的影響，進一步探討利拉魯肽對腎臟保護潛在的分子機制。

材料與方法

一、材料

1.動物 40只成年雄性Wistar大鼠(SPF級，220～240 g)購自海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。實驗大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房中，正常飲食飲水，實驗動物設(shè)計嚴(yán)格經(jīng)過我院倫理委員會審查(編號：20170816)。大鼠適應(yīng)環(huán)境兩周后進行實驗。

2.試劑 利拉魯肽購自丹麥諾和諾德公司。24 h尿蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BUN和Scr測定試劑盒購自瑞士羅氏公司。HE試劑盒、DAB顯色盒和Masson試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。大鼠一氧化氮(NO)試劑盒、大鼠丙二醛(malondialdelyde,MDA)試劑盒、大鼠過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。RIPA裂解液和BCA試劑盒購自美國promega公司。兔抗TGF-β1抗體、兔抗α-SMA抗體、兔抗β-actin抗體和山羊抗兔IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

二、方法

1.大鼠慢性腎功能模型制備 造模：大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉后，暫時阻塞腎動脈，結(jié)扎并切除2/3左腎。通過壓迫控制出血，直到停止。用聚丙烯縫合線閉合肌肉和皮膚切口。一周后，切開右腹，將腎血管和輸尿管綁扎，并切除右腎[2]。

2.分組及給藥 (1)分組：Wistar大鼠Wistar大鼠稱重, 依次編號, 以體重升序排序, 依體重順序?qū)⒋笫蠓殖扇舾蓚€區(qū)組。用Excel軟件對每個區(qū)組大鼠的體重產(chǎn)生1個隨機數(shù), 各個區(qū)組以隨機數(shù)升序排序, 以隨機數(shù)的順序?qū)⒚恐淮笫蠓秩氲?個組中：分為假手術(shù)組(sham組)、慢性腎功能衰竭組(CRF組)、利拉魯肽低劑量組(Liraglutide-L組)和利拉魯肽高劑量組(Liraglutide-H組)，共4組,每組10只。CRF組、Liraglutide-L組和Liraglutide-H組大鼠按1∶2∶1進行CRF模型制作，sham組大鼠只暴露腎臟，不切除腎組織，將其包膜及周圍脂肪組織剝離后關(guān)腹。(2)給藥：給藥方式為腹腔注射；給藥時間在CRF造模第3天。造模成功后，sham組注射無菌生理鹽水，4 mL/kg；CRF組注射無菌生理鹽水，4 mL/kg；Liraglutide-L組注射0.1 mg/kg的利拉魯肽，給藥體積為4 mL/kg；Liraglutide-H組注射0.3 mg/kg的利拉魯肽，給藥體積為4 mL/kg[9]。每天給藥2次，連續(xù)12周。

3.大鼠24 h尿蛋白定量測定 收集各組大鼠24 h尿液，采用雙縮脲法測定大鼠24 h尿蛋白定量。計算公式為：24 h尿蛋白定量=尿蛋白濃度×24 h尿量。

4.大鼠血清Scr和血清BUN水平測定 各組大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后，于心尖取血，并置于1.5 mL EP管中，3 000 r/min 離心15 min，離心半徑5 cm，吸取上層血清，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測各組大鼠Scr和BUN水平。

5.HE染色 切取新鮮腎組織，經(jīng)固定、常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，并制成4 μm的石蠟切片。按HE染色步驟經(jīng)脫蠟、脫水、染色、沖洗、中性樹膠封片，鏡下觀察腎組織的病理變化。

6.酶聯(lián)免疫吸附試驗 將各組大鼠腎組織放入9倍體積的磷酸緩沖鹽溶液中，用勻漿器分散到勻漿中，凍融3次，并在4 ℃以3 000 r/min 離心15 min，收集上清液。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測定各孔的光密度(OD值)，根據(jù)OD值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出腎組織中NO、MDA和SOD的表達。

7.免疫組織化學(xué) 腎組織經(jīng)固定，包埋，石蠟切片,脫水,緩沖液清洗，3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加非免疫動物血清20 min，滴加一抗,磷酸緩沖鹽溶液沖洗,滴加二抗,沖洗后加親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物,3，3-二氨基苯聯(lián)胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，用MIAS圖像分析系統(tǒng)分析，按照免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)在每一高倍視野中所占比例依次統(tǒng)計。目標(biāo)蛋白呈棕黃色，則為陽性表達。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)資料以Mean±SD表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠的一般情況

結(jié)果如表1所示，在造模過程中，1只大鼠死亡。在實驗期間，sham組大鼠飲食正常，皮毛茂密有光澤，體重迅速增加；CRF組大鼠皮毛枯萎，沒有光澤、食欲不振，體重明顯減輕(P<0.01)；Liraglutide-L組和Liraglutide-H組大鼠較CRF組大鼠相對活躍，體重相對增加(P<0.05)；與Liraglutide-L組比較，Liraglutide-H組大鼠體重增加更快(P<0.05)。

二、利拉魯肽對CRF大鼠腎功能的影響

結(jié)果如表2所示，與sham組比較，CRF組BUN、Scr及24 h尿蛋白定量明顯升高(均P<0.01)；與CRF組比較，Liraglutide-L組和Liraglutide-H組BUN、Scr及24 h尿蛋白定量下降(均P<0.05)。

表1 利拉魯肽對CRF大鼠死亡率和體重的影響

三、利拉魯肽對CRF大鼠腎組織氧化應(yīng)激的影響

ELISA結(jié)果表明(圖1)，與sham組比較，CRF組大鼠腎組織中NO、CAT的含量顯著降低(均P<0.001)，MDA的含量顯著升高(P<0.001)；與CRF組比較，Liraglutide-L組和Liraglutide-H組大鼠腎組織中NO、CAT的含量升高(均P<0.05)，MDA的含量下降(P<0.05)，且Liraglutide-H組作用效果更明顯(均P<0.05)。

四、利拉魯肽對CRF大鼠腎組織病理變化的影響

HE結(jié)果表明(圖2)，sham組大鼠腎組織的腎小球、腎小管是正常的；CRF組大鼠腎組織間質(zhì)區(qū)域的局灶性病變、間質(zhì)性炎癥和腎小管萎縮；而Liraglutide-L組和Liraglutide-H組大鼠腎組織形態(tài)得到了很大改善，如局灶性病變數(shù)量減少，間質(zhì)炎癥減弱和適度的腎小管萎縮，其中Liraglutide-H組大鼠腎組織形態(tài)改善情況較Liraglutide-L組明顯。

五、利拉魯肽對CRF大鼠腎組織中TGF-β1表達的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示(圖3、4)，與sham組比較，CRF組大鼠腎組織中TGF-β1的表達顯著上調(diào)(P<0.001)；與CRF組比較，Liraglutide-L組和Liraglutide-H組大鼠腎組織中TGF-β1的表達下調(diào)(P<0.05)，且Liraglutide-H組作用效果更明顯(P<0.05)。

六、利拉魯肽對CRF大鼠腎組織中α-SMA表達的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示(圖5、6)，與sham組比較，CRF組大鼠腎組織中α-SMA的表達顯著上調(diào)(P<0.001)；與CRF組比較，Liraglutide-L組和Liraglutide-H組大鼠腎組織中α-SMA的表達下調(diào)(P<0.05)，且Liraglutide-H組作用效果更明顯(P<0.05)。

表2 利拉魯肽對CRF大鼠腎功能的影響

注：與sham組比較，a P<0.001；與CRF組比較，b P<0.05，c P<0.01；與Liraglutide-L組比較，d P<0.05。圖1 各組大鼠腎組織中NO、MDA和CAT的表達比較 1A.NO;1B.MDA;1C.CAT

圖2 各組大鼠腎組織病理變化(HE染色,200×) 2A.sham組;2B.CRF組;2C.liraglutide-L組;2D.lin glutide-H組

圖3 各組大鼠腎組織中TGF-β1的表達(免疫組織化學(xué)染色,400×) 3A.sham組;3B,CRF組;3C.liraglutide-L組;3D.liralutide-H組

注：與sham組比較，a P<0.001；與CRF組比較，b P<0.05，c P<0.01；與Liraglutide-L組比較，d P<0.05。圖4 各組大鼠腎組織中TGF-β1的表達比較

圖5 各組大鼠腎組織中α-SMA的表達(免疫組織化學(xué)染色,400×) 5A.sham組;5B.CRF組;5C.Liraglutide-L組;5D.Liraglutide-H組

注：與sham組比較，a P<0.001；與CRF組比較，b P<0.05，c P<0.01；與Liraglutide-L組比較，d P<0.05。圖6 各組大鼠腎組織中α-SMA的表達比較

討 論

CRF對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，為了更好地了解其發(fā)病機制并確定有效的治療方法，通常將5/6腎切除術(shù)大鼠模型用于模擬CRF的過程[11]。5/6腎切除后，腎臟形態(tài)發(fā)生病理改變，包括腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮，最終導(dǎo)致CRF[12- 13]。目前已有多種藥物對CRF有一定的治療作用，如紅景天苷[14]、黃連堿[15]等，但是利拉魯肽對CRF保護作用尚不清楚。

氧化應(yīng)激標(biāo)記物是一系列生物化學(xué)物質(zhì)，可反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平[16]。其中，ROS、活性氮和脂質(zhì)過氧化物常用于CRF檢測，氧化應(yīng)激標(biāo)志物的測定在揭示CRF的發(fā)生和發(fā)展與氧化應(yīng)激的相關(guān)性中起著重要的作用[17]。汪衛(wèi)紅等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，CRF模型組大鼠腎組織MDA含量升高，而SOD、CAT活性均顯著降低。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CRF組大鼠腎組織中NO、CAT的含量顯著降低，MDA的含量顯著升高。

TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子，參與多種生理和病理過程，例如平滑肌分化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和組織纖維化[19]。眾所周知，TGF-β1主要負(fù)責(zé)慢性腎臟疾病中纖維化的增加[20]。體內(nèi)和體外研究表明，TGF-β1還通過激活腎小球系膜細(xì)胞并隨后促進細(xì)胞外基質(zhì)的積累而促進了腎小球硬化的病理[21-22]。另一方面，α-SMA是平滑肌細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞的常見標(biāo)志物，在腎臟中高度表達，而α-SMA的過度生產(chǎn)部分是由于腎小管上皮-成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，其在腎間質(zhì)纖維化中起重要作用[23]。于艷等[24]研究表明，CRF大鼠腎組織中TGF-β1和α-SMA蛋白表達增加。在本實驗中，CRF組大鼠腎組織中TGF-β1和α-SMA表達顯著上調(diào)，與上述文獻報道一致。

利拉魯肽的作用機制廣泛，具有降低血糖、保護心臟和抑制炎癥反應(yīng)等作用[25]。研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽對糖尿病腎病有一定的治療作用[26]，我們猜想利拉魯肽是否對CRF有治療作用，本實驗中發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽降低了CRF大鼠腎功能指數(shù)提高，腎組織中NO、CAT的含量升高，MDA的含量降低；腎組織形態(tài)得到了很大改善，如局灶性病變數(shù)量減少，間質(zhì)炎癥減弱和適度的腎小管萎縮；且大鼠腎組織中TGF-β1和α-SMA表達下調(diào)；而且高劑量利拉魯肽的作用效果比低劑量利拉魯肽的作用效果更明顯。因此，利拉魯肽對CRF有一定治療作用。

綜上所述，利拉魯肽對CRF有一定的治療作用可能與減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、下調(diào)TGF-β1和α-SMA的表達有關(guān)，但是具體的機制要更進一步的研究。