黃芩提取物局部治療實驗性牙周炎的研究

滕蕊 郭寧 趙曉丹 劉瑾 李昂 茍建重

[摘要]目的：建立SD大鼠實驗性牙周炎動物模型，觀察黃芩提取物對其IL-1β和牙槽骨骨密度等的影響。方法：建模組（牙周炎組和黃芩提取物組）在大鼠上頜第二磨牙腭側(cè)局部注射牙齦卟啉單胞菌液（P.g.W83），絲線結(jié)扎牙頸部，再局部涂抹菌液，飼以軟食;8周后采用50mg/L黃芩提取物局部給予藥物治療，4周后檢測齦溝液和唾液中的IL-1β含量及牙槽骨骨密度等變化。結(jié)果：8周后建模組大鼠雙側(cè)上頜第二磨牙腭側(cè)牙齦組織紅腫，易出血，牙周袋約3～4mm;齦溝液和唾液中IL-1β明顯升高;Micro CT顯示牙槽骨吸收達根1/2處，根分叉區(qū)可見牙槽骨吸收低密度投射區(qū)，牙周炎模型建立成功;50mg/L黃芩提取物治療4周后，齦溝液和唾液中的IL-1β明顯下降，牙槽骨密度、高度等顯著升高。 結(jié)論：該方法能夠快速、穩(wěn)定、有效地建立SD大鼠實驗性牙周炎模型，50mg/L黃芩提取物能明顯改善大鼠牙周炎組織中IL-1β和牙槽骨狀況，為牙周病的臨床防治提供實驗依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]牙齦卟啉單胞菌;SD大鼠;實驗性牙周炎;黃芩提取物;白細胞介素1β;牙槽骨

[中圖分類號]R781.4+2? ? [文獻標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）10-0115-04

The Study on Local Treatment of Experimental Periodontitis Using

Scutellaria Baicalensis Extracts

TENG Rui1， GUO Ning2， ZHAO Xiao-dan2， LIU Jin2， LI Ang2， GOU Jian-zhong2

（1.Department of Stomatology， Xi 'an Jiaotong University Hospital， Xian 710049，Shaanxi，China; 2.Periodontal Department of Stomatological Hospital of Xi'an Jiaotong University， Xian 710004 ，Shaanxi，China）

Abstract： Objective? To establish an experimental periodontitis model in SD rats rapidly， and determine the effects of Scutellariabaicalensis extracts on IL-1βand alveolar bone in SD rats. Methods? After ligated the cervical region using wire ligatures， the male SD rats in experimental group were received a direct injection of P.g.W83 into the palatal gingival tissue of the bilateral maxillary second molar. Then the P.g.W83 bacterial solution were applied locally and feed with soft food 8 weeks. The content of IL-1 β in gingival crevicular fluid and saliva and the density of alveolar bone were measured after 4 weeks using 50mg/L Scutellariabaicalensis extracts. Results? 8 weeks later， the gingival of SD rats in experimental group were red and swollen， bleeding on probe and probing depth was about 3-4mm.The levels of IL-1β both in gingivalcrevicular fluid and saliva were higher than control. The micro CT demonstrated the level of alveolar bone was destroyed to the half of teeth root of the second molar tooth. Alveolar bone resorption can be seen in the root bifurcated area and buccolingual sections.Theseindicated that the periodontitis model in SD rats was established successfully. After 4 weeks of treatment with 50mg/L Scutellariabaicalensis extract， the level of IL-1β in decreased significantly， and the density and height of alveolar bone increased significantly. Conclusion? This method can be used to establish an experimental periodontal in SD rats rapidly， and 50 mg/L Scutellariabaicalensis extract can significantly decrease the level of IL-1β and improve alveolar bone in periodontitis.It can provide a basis for further study on etiology，prevention and treatment of periodontitis.

Key words： Porphyromanusgingivalis（P.g.）;SD rats;experimental periodontitis;Scutellariabaicalensis extracts;IL-1β;alveolar bone

牙周病作為一種口腔常見病和多發(fā)病，是由細菌感染引起的慢性炎癥性疾病，隨病變發(fā)展會導(dǎo)致牙周支持組織（牙齦、牙周膜、牙骨質(zhì)及牙槽骨）的持續(xù)性破壞，最終引起成年人牙齒喪失[1]。建立牙周病的動物實驗?zāi)Ｐ?，對于了解其病因、起源、病理發(fā)展、診斷，以及采用新型生物材料和藥物防治牙周病至關(guān)重要，一直是口腔科學(xué)的研究重點之一[2-3]。目前，SD大鼠是建立牙周炎模型的主要動物[4-5]。黃芩提取物可緩解牙齦卟啉單胞菌膜泡抑制牙周膜成纖維細胞堿性磷酸酶活性，刺激細胞成骨轉(zhuǎn)化，利于病變愈合[6];還可降低牙周膜細胞表面RANKL/OPG比值，引起RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞數(shù)量減少，炎性因子下降，從而使牙槽骨喪失減緩或停止，最終減輕牙周炎癥[7-8]。本研究擬采用牙齦卟啉單胞菌和結(jié)扎絲聯(lián)用的方法，同時飼以軟食，快速、簡便、穩(wěn)定地建立SD大鼠的實驗性牙周炎動物模型，再采用50mg/L黃芩提取物局部治理，研究齦溝液、唾液中IL-1β含量和牙槽骨的變化，探討黃芩提取物對牙周炎大鼠炎癥和骨代謝的影響，為臨床進一步運用其作為新的牙周炎治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1? 材料和方法

1.1 動物選擇和分組：60只SD大鼠，清潔級，雄性，牙列完整，無齲壞及牙周病，體重（170±10）g（由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供）。隨機分其中的40只大鼠為建模組，20只大鼠為對照組;待建模成功后，將建模組大鼠隨機再分為兩組：牙周炎組和黃芩提取物治療組，每組20只大鼠。

1.2 牙齦卟啉單胞菌P.g W83菌液制備：牙齦卟啉單胞菌（Porphyromanusgingivalis， P.gW83），購于首都醫(yī)科大學(xué)，由空軍軍醫(yī)大學(xué)微生物實驗室培養(yǎng)。將1×107的P.g W83細菌溶于1ml的無菌PBS中，混勻，即得注射用菌液;取上述注射用菌液0.5ml與等量PBS液混勻，即得涂抹用菌液。

1.3 實驗試劑：黃芩提取物購自陜西飛達生物有限公司（質(zhì)控指標(biāo)黃芩素含量80%），使用時用滅菌水制成50mg/L的溶液進行局部注射，水合氯醛（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），IL-1β酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（R&D）。

1.4 實驗方法

1.4.1 建立SD大鼠實驗性牙周炎模型：在500ml滅菌水中加入復(fù)方新諾明混懸液10ml，代替所有大鼠日常飲水進行抗生素預(yù)處理1周，再換回正常飲水1周。建模組：1%戊巴比妥鈉按照5ml/kg體重進行腹腔麻醉后，開口器撐開口角（見圖1A）在雙側(cè)上頜第二磨牙（見圖1B）腭側(cè)牙齦溝底注射菌液20μl（見圖1C），并使用結(jié)扎絲線結(jié)扎牙頸部（見圖1D），頰側(cè)打結(jié)，并盡量壓入牙齦溝內(nèi)，然后于結(jié)扎絲線涂抹100μl菌液。每隔2天重復(fù)一次，共4次;對照組：腹腔麻醉后，在雙側(cè)上頜第二磨牙腭側(cè)牙齦溝底注射20μl無菌PBS，并涂100μl的PBS溶液，每隔2天重復(fù)1次，共4次。建模期間，所有大鼠均飼以軟食。

之后每隔2周，檢查絲線脫落情況，若絲線脫落再行結(jié)扎，未脫落者進一步壓向牙齦溝底，同時觀察兩組大鼠的牙周情況。

注：A.開口器撐開SD大鼠口腔;B.上頜第二磨牙;C.第二磨牙腭側(cè)牙齦溝底注射菌液;D.結(jié)扎絲結(jié)扎上頜第二磨牙牙頸部

1.4.2 藥物治療SD大鼠牙周炎：按照前述實驗分組，待8周后建模成功，建模組SD大鼠均去除牙頸部結(jié)扎絲，黃芩提取物藥物治療組于雙側(cè)上頜第二磨牙腭側(cè)牙齦溝底注射50mg/L藥液50μl，牙周炎組注射等量PBS溶液，每隔1天注射1次，一共4次;對照組不進行特殊處理。所有實驗大鼠繼續(xù)喂飼軟食。

1.4.3 樣本采集：建模8周和黃芩提取物藥物治療4周后，使用濾紙條采集大鼠建模牙齒腭側(cè)的齦溝液，唾液（見圖2），標(biāo)本均于-70℃保存。

注：A.采用濾紙條法取SD大鼠齦溝液;B.采用濾紙條法取SD大鼠唾液

檢測前將取齦溝液和唾液的所有濾紙條剪碎后加入1ml的PBS（0.01mol/L，pH值7.4）進行充分勻漿，然后離心（轉(zhuǎn)速為3 000rpm）取上清液待檢。按照ELISA檢測試劑盒說明書步驟進行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出唾液及齦溝液中的IL-1β含量。

1.4.4 影像學(xué)檢查：建模8周后建模組和對照組各處死部分SD大鼠，藥物治療4周后處死全部大鼠，取雙側(cè)上頜骨置于10%福爾馬林中進行固定，漂洗并去除軟組織，保留硬組織，將樣本置于Micro-CT系統(tǒng)的檢測試管內(nèi)，540°掃描（掃描分辨率10.44μm×10.44μm），最后使用Cobra軟件進行三維重建，觀察各組大鼠牙槽骨吸收情況。同時使用VIVID軟件，分析牙槽骨各項參數(shù)，包括相對骨體積（BV/TV），骨表面積體積比（BSA/BV），骨小梁厚度（Tb·Th），骨小梁數(shù)目（Tb·N），骨小梁間隙（Tb·Sp），骨小梁模型因子（Tb·Pf）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：將實驗所得數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果以x?±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 建模8周后SD大鼠大體觀察：8周后，建模組大鼠皮毛無光澤、進食減少、活動笨拙，雙側(cè)上頜第二磨牙腭側(cè)牙齦組織紅腫，易出血，牙周袋約3～4mm（見圖3A～B）;對照組大鼠毛澤光亮，飲食飲水正常，活動正常，雙側(cè)上頜第二磨牙腭側(cè)牙齦組織無紅腫，無出血，無牙周袋（見圖3C）。

注：A.建模組，齦溝出血指數(shù)（SBI）=4;B.建模組，牙周探診深度約2mm;C.對照組，牙齦色、形、質(zhì)正常

2.2 建模8周后SD大鼠齦溝液和唾液中IL-1β含量：建模8周后，齦溝液和唾液中的IL-1β通過ELISA試劑盒檢測后結(jié)果見表1。建模組齦溝液和唾液中的IL-1β明顯高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且齦溝液中的差異大于唾液（P<0.05）。

2.3 建模8周后SD大鼠頜骨組織Micro CT檢查結(jié)果：Micro CT圖像可見，實驗組雙側(cè)上頜第二磨牙牙槽骨吸收達根中1/2處，根分叉區(qū)可見低密度投射區(qū)，且二維的近遠中向和頰舌向斷面也可見牙槽骨吸收的低密度暗影（紅色箭頭所指區(qū)域）（見圖4A～D）;對照組雙側(cè)上頜第二磨牙牙槽骨高度正常，根分叉區(qū)和二維的的近遠中向和頰舌向斷面均見骨高度和骨密度無明顯異常（紅色箭頭所指區(qū)域）（見圖5A～D）。

2.4 黃芩提取物局部治療4周后SD大鼠齦溝液和唾液中IL-1β含量：采用50mg/L黃芩提取物局部治療4周后，齦溝液和唾液中的IL-1β含量見表2。藥物治療組的齦溝液和唾液中IL-1β明顯下降，和牙周炎組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 黃芩提取物局部治療4周后SD大鼠牙槽骨變化：采用50mg/L黃芩提取物局部治療4周后，SD大鼠牙槽骨組織的骨參數(shù)分析見表3，相對于建模后未進行治療的牙周炎組，經(jīng)過藥物治療組的各組參數(shù)均有顯著的變化：相對骨體積（BV/TV），骨表面積體積比（BSA/BV），骨小梁厚度（Tb·Th），骨小梁數(shù)目（Tb·N），骨小梁間隙（Tb·Sp）比牙周炎組升高，而骨小梁模型因子（Tb·Pf）比牙周炎組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;和對照組比較，相對骨體積、骨小梁厚度及骨小梁模型也有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

3? 討論

實驗性牙周炎動物模型的建立方法有很多種[5，9-10]，1964年，Keyes等利用高湯低蛋白飼料（Keyes 2000）就成功誘導(dǎo)地鼠典型的牙周炎癥狀，有學(xué)者利用絲線結(jié)扎動物牙頸部造成菌斑滯留也是較為常用的建模方法，接種牙周可疑致病菌也是較為常用的建立牙周炎動物模型的方法。目前，已有多種方法將可疑的牙周病原菌成功接種于實驗動物口腔內(nèi)[11-12]。將108～109濃度的牙周可疑致病菌接種于口腔2～3次，有或無絲線結(jié)扎可用于牙周炎模型構(gòu)建[13];另有學(xué)者使用浸有P.g的線結(jié)扎牙頸部，也可以建立有效的牙周炎模型，能使牙槽骨破壞位點特異化;并且證明至少105的P.g.W83就很容易定植在大鼠的牙齦溝內(nèi)，在一次細菌接種后15周仍有58%的細菌檢出率，且細菌感染組在感染后的13～15周觀察到了非常明顯的牙槽骨喪失量[14]。

上述各種方法均是誘導(dǎo)動物的實驗性牙周炎模型的方法，但是存在實驗時間長、不穩(wěn)定的問題，因此，本研究將以上方法聯(lián)合應(yīng)用，采用同時接種牙周致病菌P.g W83+絲線結(jié)扎牙頸部+喂飼軟食，8周后通過口腔檢查情況，齦溝液和唾液中炎性因子IL-1β的含量，牙槽骨變化等說明，此方法可快速、穩(wěn)定構(gòu)建無缺陷SD大鼠的實驗性牙周炎模型。

牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，牙周炎癥期間可以產(chǎn)生許多細胞因子。其中IL-1β是參與牙周炎骨破壞作用最經(jīng)典的細胞因子，它在牙周炎的進展中發(fā)揮著重要作用，很多研究均證實，IL-1β水平在牙周炎癥部位較健康組織顯著升高，經(jīng)過治療后其水平明顯下降，因此可作為牙周炎的診斷指標(biāo)之一[15-16]。在本研究中，同時收集了實驗大鼠的齦溝液和唾液，通過酶聯(lián)免疫吸附ELISA實驗測定IL-1β的含量。結(jié)果顯示，建模后的齦溝液（P<0.01）和唾液（P<0.05）中的IL-1β水平有顯著上升，經(jīng)過黃芩提取物的藥物治療后，相對于建模的牙周炎組，其含量均明顯下降，說明藥物治療4周后就可以明顯改善牙周炎的炎癥癥狀。

牙周炎的癥狀主要包括牙齦炎癥、牙周袋的形成、牙槽骨喪失及牙齒的松動甚至脫落。在本研究中，實驗組觀察到了明顯的牙齦炎癥，牙周袋的深度約3～4mm。Micro CT 檢測了牙槽骨的喪失情況，在上頜第二磨牙的腭側(cè)和根分叉區(qū)觀察到了明顯的牙槽骨喪失影像。盡管同時筆者觀察到了第一磨牙和第三磨牙也見有牙槽骨吸收，但第二磨牙因有局部注射菌液、結(jié)扎絲線和涂抹在絲線表面的活菌，以及黏附在絲線上的軟食，其牙槽骨的吸收程度更嚴重。通過Micro CT測量骨小梁指標(biāo)時一般采用三維參數(shù)計量，其中相對骨體積（BV/TV），骨表面積體積比（BSA/BV），骨小梁厚度（Tb·Th），骨小梁數(shù)目（Tb·N），骨小梁間隙（Tb·Sp）數(shù)值越大說明骨的健康狀況越好;而骨小梁模型因子（Tb·Pf）是表示骨小梁連續(xù)性的參數(shù)，其值越小表示骨小梁的連續(xù)性越好。表3的骨參數(shù)分析表明，相對于建模后的牙周炎組，經(jīng)過黃芩提取物治療的各組參數(shù)均有顯著的變化（P<0.05），說明此藥物具有一定的促成骨作用，可以用于牙周骨組織再生;同時和對照組相比較，相對骨體積、骨小梁厚度及骨小梁模型這幾個參數(shù)也有統(tǒng)計學(xué)差異，說明藥物治療組的骨組織尚未達到完全的恢復(fù)，這可能和藥物作用時間較短（只有4周）有關(guān)系，在后續(xù)實驗中筆者會延長藥物治療時間和觀察時間，希望取得更好的促進牙周骨組織再生的效果。

本研究快速、穩(wěn)定、有效地建立SD大鼠的實驗性牙周炎模型，模擬牙周炎發(fā)展進程;采用50mg/L黃芩提取物局部治療4周后，齦溝液、唾液中炎性因子IL-1β含量明顯下降，牙槽骨有一定程度的恢復(fù)，說明黃芩提取物可改善大鼠牙周炎的炎癥狀況，促進骨代謝，為臨床進一步運用其作為新的牙周炎治療藥物奠定基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2020-01-09

本文引用格式：滕蕊，郭寧，趙曉丹，等.黃芩提取物局部治療實驗性牙周炎的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2020，29（10）：115-119.