慢性肺曲霉菌病血清學(xué)檢測(cè)的研究進(jìn)展

王 月，劉子航，吳珊珊，別福鑫，張 麗

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院研究生院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，黑龍江 牡丹江 157011)

曲霉菌病在臨床中以各種形式存在，世界范圍內(nèi)的曲霉菌病患病率約為800萬，其中慢性肺曲霉菌病(chronic pulmonary aspergillus，CPA)達(dá)300萬。CPA的5年生存率估計(jì)為50%，與特發(fā)性肺纖維化相似[1]。據(jù)估計(jì)全世界300萬CPA患者中，五年死亡率高達(dá)85%[2]，被認(rèn)為是最難治的肺部感染性疾病之一。不能及時(shí)的對(duì)疾病做出正確診斷是導(dǎo)致CPA病死率高的原因之一。所以早期快速診斷對(duì)疾病有重要作用，可及時(shí)控制病情，改善預(yù)后，對(duì)曲霉病的診斷提出了許多挑戰(zhàn)。CPA診斷基于慢性癥狀，放射學(xué)變化和實(shí)驗(yàn)室檢查[2-4]。不幸的是，咳嗽和呼吸困難等癥狀沒有特異性，可能與潛在的其他肺部疾病重疊。而影像學(xué)上的空洞、纖維化和胸膜增厚等改變也可能與其他肺部疾病重疊，僅在少數(shù)病人檢查出特有曲菌球[3-5]，因此實(shí)驗(yàn)室檢查至關(guān)重要。

1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)展

傳統(tǒng)的真菌實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括臨床樣本的直接顯微鏡檢查、組織病理學(xué)檢查和真菌培養(yǎng)的方法。顯微鏡檢查靈敏度因標(biāo)本的來源和質(zhì)量以及檢驗(yàn)師的技能和經(jīng)驗(yàn)而異。組織病理學(xué)檢查可能需要使用深部組織的活組織檢查，易對(duì)患者構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)。真菌培養(yǎng)可能有所幫助，但培養(yǎng)對(duì)曲霉菌病診斷的敏感性較低。靈敏、特異、快速的診斷方法已成為CPA研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著檢測(cè)水平的不斷提高，目前不同于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)在CPA檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮非常重要的作用。血清學(xué)是一種微創(chuàng)樣本，不受患者病情和身體狀況的限制。血清學(xué)的診斷主要包括抗原、抗體檢測(cè)兩類。抗原檢測(cè)為1，3-β-D-葡聚糖檢測(cè)和半乳甘露聚糖檢測(cè)?？贵w檢測(cè)主要有：曲霉IgA、IgE、IgG、IgM抗體。

2 血清學(xué)抗原檢測(cè)

2.1 1,3-β-D-葡聚糖檢測(cè)(G實(shí)驗(yàn))1,3-β-D-葡聚糖(1,3-β-D-glucan，BG)是曲霉菌細(xì)胞壁的多糖組分，G實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是BG，吞噬細(xì)胞吞噬真菌后，能持續(xù)釋放BG入血。G實(shí)驗(yàn)適用于大多數(shù)深部真菌感染的早期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種和菌屬。因此G實(shí)驗(yàn)為陽性時(shí)無法確診是否為肺曲霉菌感染。G實(shí)驗(yàn)有其局限性，以下情況可出現(xiàn)假陽性：(1)使用纖維素膜進(jìn)行血透；(2)食用菌類食物可以導(dǎo)致假陽性[6];(3)靜脈輸注免疫球蛋白、清蛋白、凝血因子或血液制品；(4)測(cè)試材料含葡聚糖。

2.2 半乳甘露聚糖檢測(cè)(GM實(shí)驗(yàn))半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)最初是在感染免疫抑制的兔血清中被發(fā)現(xiàn)的煙曲霉抗原，是一種存在于大多數(shù)曲霉屬細(xì)胞壁中的多糖，廣泛分布于曲霉菌細(xì)胞壁中。曲霉菌生長(zhǎng)時(shí)半乳甘露聚糖從薄弱的菌絲頂端釋放，當(dāng)這些成分進(jìn)入人體血液或深部組織、被吞噬細(xì)胞吞噬消化后，半乳甘露聚糖從細(xì)胞壁被釋放。因此，對(duì)GM檢測(cè)是曲霉菌感染的敏感指標(biāo)[7-8]。GM檢測(cè)目前廣泛用于粒細(xì)胞缺乏的侵襲性曲霉菌病的診斷，在感染的早期階段，抗原可能存在于血清或其他可以檢測(cè)GM的其他體液中，反復(fù)進(jìn)行抗原檢測(cè)可以為機(jī)會(huì)性真菌病提供可靠依據(jù)。但GM檢測(cè)在CPA中診斷價(jià)值有限。有研究認(rèn)為僅25%左右的CPA 患者呈陽性[5,9]。GM檢測(cè)的樣本有腦脊液、血清、支氣管灌洗液。近年對(duì)肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中GM的檢測(cè)也逐漸增多，多數(shù)臨床研究認(rèn)為 BALF-GM 對(duì)肺曲霉病診斷的優(yōu)于血清。楊淑喬[10]等對(duì)BALF-GM肺曲霉病的診斷作出研究，BALF-GM臨界值為0.5時(shí)對(duì)肺曲霉病診斷率為0.813。當(dāng)然GM也有其局限性，GM假陽性的因素有：(1)使用β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、喹諾酮類等抗生素[11]；(2)腎臟疾病導(dǎo)致腎清除率降低；(3)做GM檢測(cè)前食用牛奶等高蛋白食物或受污染的大米。GM假陰性的原因：通常與服用抗真菌藥物有關(guān)。

3 血清學(xué)抗體檢測(cè)

鑒于抗原檢測(cè)靈敏度、特異度低，所以對(duì)于CPA的診斷價(jià)值不大[12]。迄今為止，檢測(cè)到抗曲霉菌抗體被認(rèn)為是最可靠的方法，過去對(duì)曲霉抗體檢測(cè)的研究較少，隨著近年來CPA患病率日益增多，且診斷率不高，研究人員越來越關(guān)注曲霉抗體檢測(cè)在CPA診斷的作用。真菌抗體血清學(xué)檢測(cè)已在國(guó)外臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用，但在國(guó)內(nèi)對(duì)真菌抗體血清學(xué)檢測(cè)對(duì)慢性肺曲霉菌病診斷價(jià)值相關(guān)報(bào)道甚少。

3.1 曲霉IgM抗體曲霉菌在生長(zhǎng)周期的不同階段產(chǎn)生許多不同的抗原，這些抗原以不同的方式與免疫系統(tǒng)相互作用[13]，IgM可與不同的曲霉屬抗原的組合。隨著時(shí)間的推移，IgM可能被反復(fù)再刺激，在CPA中曲霉IgM抗體可升高。但I(xiàn)gM抗體可針對(duì)多種曲霉抗原，可以在一段時(shí)間內(nèi)保持陽性。因此，曲霉IgM抗體檢測(cè)特異性差，限制了其效用。2019年郭益群等人[14]研究中得出曲霉菌IgM抗體在CPA定植和其他肺病組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但該標(biāo)志物的敏感性和特異性受到限制。此外，與單次使用曲霉特異性IgG測(cè)試相比，曲霉IgG和IgM測(cè)試的組合在CPA的診斷方面沒有表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。想確定曲霉IgM具有曲霉菌IgG不具有的早期診斷價(jià)值，需要進(jìn)行更多高質(zhì)量，大樣本的研究以進(jìn)一步驗(yàn)證。目前認(rèn)為曲霉菌特異性IgM對(duì)CPA的診斷價(jià)值有限。

3.2 曲霉IgA抗體這種免疫球蛋白類型通常與粘膜免疫有關(guān)，并且隨著粘膜不斷暴露于真菌生長(zhǎng)，它可能持續(xù)升高。曲霉IgA抗體同IgM抗體因其特異性差，在CPA中診斷作用不大。

3.3 曲霉IgE抗體曲霉IgE抗體滴度為陽性時(shí)對(duì)CPA臨床診斷有一定的診斷價(jià)值。偶爾，具有CPA癥狀和或放射學(xué)變化的患者，但是曲霉菌特異性IgG水平正常，曲霉菌特異性IgA、IgE測(cè)試可能存在一定的診斷價(jià)值。

3.4 曲霉IgG抗體2015年歐洲呼吸學(xué)會(huì)和歐洲臨床微生物與感染學(xué)會(huì)發(fā)布首個(gè)慢性肺曲霉病診斷與治療指南[15]，提到曲霉特異性IgA、IgE、IgM、IgG抗體檢測(cè)在CPA診斷均有作用，但曲霉菌IgG抗體的檢測(cè)靈敏度及特異度更高，因此對(duì)曲霉IgG抗體的血清檢測(cè)被認(rèn)為是診斷CPA最可靠的方法[16]。2016年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)關(guān)于曲霉病診斷與處置指南中，特別強(qiáng)調(diào)了曲霉IgG抗體檢測(cè)是慢性空洞性肺曲霉病診斷中靈敏度最高的診斷方法[17]。對(duì)于由煙曲霉引起的慢性肺曲霉病，IgG檢測(cè)具有90%～95%的敏感性，甚至優(yōu)于高容量培養(yǎng)技術(shù)。當(dāng)然，曲霉IgG抗體檢測(cè)對(duì)于急性侵襲性肺曲霉菌病中抗體檢測(cè)陽性率較低，因?yàn)槊庖咭种茣?huì)導(dǎo)致抗體反應(yīng)延遲或缺失。目前，曲霉IgG抗體對(duì)CPA的診斷價(jià)值在國(guó)外已經(jīng)被廣泛的研究，特別是日本，已經(jīng)用于CPA的診斷，在中國(guó)曲霉IgG抗體對(duì)CPA的研究相關(guān)報(bào)道甚少。2019年國(guó)內(nèi)首例對(duì)曲霉菌IgG檢測(cè)對(duì)CPA的診斷作出研究，郭益群等人[14]在研究中得出，曲霉菌特異性IgG水平顯著高于其他肺病組中測(cè)定的水平。曲霉IgG抗體在CPA陽性率為76.2%。數(shù)據(jù)表明了曲霉菌IgG抗體對(duì)中國(guó)人CPA的診斷價(jià)值，進(jìn)一步為中國(guó)患者的曲霉特異性IgG診斷標(biāo)準(zhǔn)提供了有價(jià)值的見解。研究也得出了曲霉菌IgG抗體可區(qū)分CPA與其他肺部疾病，對(duì)CPA具有重要的診斷價(jià)值。此外，曲霉菌特異性IgG對(duì)感染和定植鑒定的診斷價(jià)值非常寶貴。隨后，楊淑喬[10]等對(duì)肺曲霉菌病患者(侵襲性肺曲霉菌病和CPA)的研究，得出140 kAU/L為臨界值時(shí)，曲霉 IgG抗體的陽性率為77%。

4 血清學(xué)檢驗(yàn)方法

4.1 抗原檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)GM的方法包括酶免疫測(cè)定(enzyme immunoassay，EIA)、放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)和乳膠凝集法 (latex agglutination，LA),其中以EIA敏感性最高。EIA最初僅針對(duì)血清標(biāo)準(zhǔn)化，后來針對(duì)BALF標(biāo)準(zhǔn)化。由于肺部最常受到曲霉病的影響，因此在中BALF檢測(cè)GM已經(jīng)占據(jù)了顯著位置。BALF中的GM對(duì)非血液病患者(慢性阻塞性肺疾病、重癥監(jiān)護(hù)病房等患者)具有高靈敏度和特異性。EIA在全世界被用于GM檢測(cè)，此檢測(cè)方法根據(jù)不同廠家的試劑盒有不同的陽性指數(shù)(IP)。國(guó)內(nèi)外對(duì)于GM 檢測(cè)陽性臨界值的選擇仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。日本學(xué)者一項(xiàng)研究提到，在CPA 患者中cut-off = 0.5時(shí)陽性率較高。

4.2 抗體檢測(cè)技術(shù)目前有許多檢測(cè)曲霉屬特異性抗體的方法，但對(duì)這些檢測(cè)方法均在資源充足的醫(yī)療環(huán)境中進(jìn)行的。雖然高收入的國(guó)家診斷率高，但據(jù)統(tǒng)計(jì)，患病率比較高的為中低收入的國(guó)家。由于曲霉菌易好發(fā)于肺結(jié)核患者中，大多數(shù)由肺曲霉菌引起的慢性病例發(fā)生于資源匱乏或醫(yī)療水平有限的地區(qū)，所以簡(jiǎn)單、易行以及不需昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員的檢測(cè)技術(shù)對(duì)CPA患者治療及預(yù)后起著至關(guān)重要的作用。在過去的50年中已經(jīng)開發(fā)了許多曲霉抗體檢測(cè)系統(tǒng)，可用的技術(shù)包括免疫擴(kuò)散(Immunodiffusion，ID)，免疫電泳(Immunoelectrophoresis，IEP)，補(bǔ)體結(jié)合(Complement bindingCF)和酶聯(lián)免疫測(cè)定(enzyme linked immunoassay，EIASA)。CF相當(dāng)耗費(fèi)人力，并依賴于人類對(duì)結(jié)果的解釋，故很少應(yīng)用。ID技術(shù)已經(jīng)普遍使用超過70年。在技術(shù)嫻熟的人手中，它可能是一項(xiàng)有用的測(cè)試，但該技術(shù)非常耗時(shí)，實(shí)驗(yàn)室之間的標(biāo)準(zhǔn)化和復(fù)制極具挑戰(zhàn)性，目前已被ELISA取代[18-19]。因?yàn)镮EP、ID其靈敏度相似，但I(xiàn)EP檢測(cè)所需的時(shí)間短，IEP在很大程度上取代了ID。法國(guó)醫(yī)學(xué)真菌學(xué)會(huì)專家委員會(huì)對(duì)于曲霉菌血清學(xué)的檢驗(yàn)技術(shù)報(bào)道，認(rèn)為曲霉ELISA和IEP分別是最常用的診斷技術(shù)。但研究中也提到，IEP有一定的局限性，包括敏感性差，主觀定性結(jié)果和勞動(dòng)強(qiáng)度大。用于檢測(cè)曲霉菌免疫球蛋白類的ELISA檢測(cè)最初開發(fā)于20世紀(jì)80年代。在過去十年中，已經(jīng)開發(fā)出幾種商業(yè)曲霉菌 ELISA，現(xiàn)在廣泛用于CPA診斷。商業(yè) ELISA具有完全自動(dòng)化和結(jié)果定量的優(yōu)勢(shì)，目前有許多商業(yè)產(chǎn)品可供使用，并提供了關(guān)于曲霉屬宿主抗體反應(yīng)的大量信息。這種技術(shù)允許檢測(cè)各種類型的抗體。該檢測(cè)技術(shù)可以完全自動(dòng)化，從而降低人工成本，并可在兩小時(shí)內(nèi)出結(jié)果，檢測(cè)陽性率較高。據(jù)報(bào)道，商業(yè)ELISA的靈敏度和特異性分別為75%至98%和84%至99%。制造商提供參考值以區(qū)分升高的水平與正常水平。最佳臨界值的鑒定對(duì)于曲霉屬ELISA測(cè)定是至關(guān)重要的?？骨箍贵w的ELISA結(jié)果高于健康個(gè)體的水平則定義為異常[18]。由于慢性疾病中的抗體水平可能遠(yuǎn)高于過敏性或急性侵襲性疾病，因此臨界值可能無法針對(duì)CPA進(jìn)行優(yōu)化。

5 小結(jié)

綜上所述，血清學(xué)檢測(cè)中G實(shí)驗(yàn)適用于大多數(shù)真菌感染的早期階段，但不能確定菌種和菌屬。GM實(shí)驗(yàn)是肺曲霉菌感染的敏感指標(biāo)，但在CPA患者中陽性率低。所以，曲霉IgG抗體對(duì)CPA的檢測(cè)是最可靠的方法。由于大多數(shù)肺曲霉菌病患者生活在資源匱乏的環(huán)境中，需要一種適合在這種情況下廣泛使用的檢測(cè)方法。商業(yè)ELISA檢測(cè)技術(shù)可以完全自動(dòng)化，敏度性、特異性、陽性率高，值得推廣使用。