何偉強 劉慈斌 何偉源
(1 廣東鼎銘藥業(yè)有限公司 廣東 汕頭 515000)
(2 汕頭市中心醫(yī)院 廣東 汕頭 515000)
陳皮又稱為橘柚,是蕓香科植物橘的干燥果皮,主要成分為黃酮和揮發(fā)油。2010 年藥典認為橙皮苷是陳皮的重要成分,近年來發(fā)現(xiàn)川陳皮素和橘皮素是陳皮含量較高的多甲基黃酮類物質(zhì)(PMFs)[1]。廣陳皮是茶枝柑的干燥果皮,主要產(chǎn)自于廣東省新會地區(qū),具有較高的食用和藥用價值,是廣東三寶之首、廣東十大中藥材之一[2]。廣陳皮具有清除自由基、抗氧化、祛痰、促進腸道平滑肌運動、促進消化等作用,臨床上用于治療功能性消化不良等疾病[3]。PMFs 是甲氧基≥4 的黃酮類化合物。PMFs 抗氧化、抗炎癥反應、抗腫瘤活性、抗動脈粥樣硬化[4]。本研究采用高速逆流色譜法(HSCCC)從廣陳皮中分離多甲基黃酮類物質(zhì)(PMFs)。
高速逆流色譜儀(TBE-300),高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent-1200),質(zhì)譜儀,超導核磁共振儀,純凈水,分析純試劑和無水乙醇。廣陳皮,經(jīng)過鑒定為茶枝柑的成熟果皮。
(1)PMFs 的提取和富集:廣陳皮干燥后過目篩得出粉末1000g,粉末加入2000ml 的燒瓶中,加入1000ml 95%的乙醇,加熱回流1h,重復3 次后合并3 次提取液得到醇提出物。加入適量水懸浮裝入樹脂層析柱,靜止1h,采用水、75%甲醇和95%甲醇洗脫接收洗脫物,濃縮后得到棕黃色粉末,放入冰箱內(nèi)保存。
(2)容積體系和樣本溶液的選擇:HSCCC 的溶劑為正乙烷:乙酸乙酯、甲醇:水(4:6:4:6)加入漏斗中,充分混勻后靜止得到固定相和流動相,超聲洗脫30min 備用。
(3)固定相和流動相的選擇:下相為固定相,上相為流動相時分離基線不穩(wěn)定,固定相丟失,因此上相為固定相,下相為流動相。
(4)流動相體積流量、柱溫和轉速的選擇:流動相過低導致分離周期延長,過高導致分離效果較差。柱溫過低導致固定相丟失,柱溫過高導致出現(xiàn)氣泡影響分離。轉速越快固定相保留率越高。因此流動相體積流量、柱溫和轉速分別為2L/min、860r/min35℃。
(5)HSCCC分離制備:固定相20ml/min的速度加入分離管中,充滿管路,轉速860r/min,液體相2L/min 注入,柱溫35℃,按照色譜峰接受目標的餾分。得到A、B、C、D、E 5 個成分。
合適的溶劑系統(tǒng)是HSCCC 的關鍵步驟,根據(jù)分離物的極性和參考文獻,本研究選擇正乙烷:乙酸乙酯、甲醇:水、氯仿:甲醇:水、乙酸乙酯:乙醇、水、氯仿:甲醇、正丁醇、水不同的溶劑系統(tǒng)進行分析,樣本的分離系數(shù)k需要在一個合適的范圍,如果k≤0.5出峰時間太快,分離變差;如果k≥1出峰時間太長,峰形變寬,本研究選擇正乙烷:乙酸乙酯、甲醇:水上機試驗,可分離出5 種PMFs 單體,圖譜的峰形較好。
對5 個成分進行檢測,面積歸化法測定A、B、C、D、E 的純度分別為99.5%、98.7%、99.0%、86.3%、83.2%。D、E 純度不足,需要進一步純化處理。
化合物A 無色針狀結晶(甲醇),分子式為C21H22O8,光譜數(shù)據(jù)與文獻報道一致,故化合物A 為5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮(川陳皮素)[5]?;衔顱 黃色針狀結晶(乙酸乙酯),分子式為C22H24O9,光譜數(shù)據(jù)與文獻報道一致,故化合物B 為3,5,6,7,8,3’,4’—七甲氧基黃酮。化合物無色針狀結晶(甲醇),分子式為C20H20O7,光譜數(shù)據(jù)與文獻報道一致,故化合物C 為5,6,7,8,4’-五甲氧基黃酮(橘皮素)。
HSCCC 起源于20 世紀80 年代新型液液分離系統(tǒng),固定相和液體相均為液體,利用溶質(zhì)在互不相溶的溶液中分散系數(shù)不同進行分離,由于不需要固體介質(zhì)避免固體填塞造成樣本丟失,全部回收樣品,分離量大,快速高效。分離柱容積大,無填料,柱內(nèi)空間均為有效空間,制備量從毫克到克量級;溶劑用量少,成本低;適用于分離純化。
應用HSCCC 分離天然產(chǎn)物需要選擇良好的容積,控制上下兩層在30s 內(nèi)乳化,k值盡量控制在0.5 ~1 確定最佳的熔劑系統(tǒng),此外選擇合適的流動相體積流量、柱溫和轉速亦十分重要。
綜上所述,采用HSCCC 分離得到純度高的化合物,簡便可行,不僅可以作為廣陳皮質(zhì)量控制的參考物質(zhì),而且為柑橘類植物分類提供科學的依據(jù)。