馬其雪，孫向陽，李素艷，李 松，劉源鑫，周文潔

(北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，北京 100083)

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，重金屬污染問題日益凸顯。鉛和鋅是污染環(huán)境的主要重金屬，據(jù)2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，鉛、鋅的點(diǎn)位超標(biāo)率分別達(dá)到了1.5%和0.9%[1]。蔬菜種植區(qū)受鉛、鋅污染的問題尤為嚴(yán)重[2]，土壤中過量的鉛、鋅會遷移到蔬菜中[3]，引起蔬菜生理特性的改變。有研究表明，鉛、鋅可以與小白菜葉片中的葉綠素結(jié)合，造成葉綠素正常結(jié)構(gòu)和功能的損壞，影響其光合作用，從而對小白菜生長產(chǎn)生不利影響[4]。鉛、鋅脅迫還會導(dǎo)致蕹菜體內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞，體內(nèi)抗氧化酶活性下降，嚴(yán)重影響蕹菜品質(zhì)[5]。

施用土壤改良劑，可以固定土壤中的鉛、鋅，減輕鉛、鋅對蔬菜的氧化脅迫作用，改善蔬菜的生理特性[6]。目前，常用的土壤改良劑主要有含磷物質(zhì)[7]、粉煤灰[8]、生物炭[9]、有機(jī)廢棄物[10]和堆肥[11]等，它們能有效降低重金屬在土壤中的移動性，緩解重金屬對植物的毒害作用，且成本低廉。其中，堆肥是借助微生物作用將城市污泥、畜禽糞便、生活垃圾、園林綠化廢棄物等有機(jī)固體廢棄物進(jìn)行無害化、資源化的產(chǎn)物[12]。堆肥主要通過吸附、沉淀、絡(luò)合和氧化還原反應(yīng)來固定土壤中的重金屬，降低其生物有效性，減少植物對重金屬的吸收，從而緩解重金屬對植物的氧化脅迫[13]。此外，堆肥本身還具有較高的營養(yǎng)價值，可提供植物生長所需的多種營養(yǎng)元素[14]。受堆肥原材料固有屬性的影響，有些堆肥，如污泥堆肥、畜禽糞便堆肥中重金屬含量過高，應(yīng)用到土壤中，可能會造成更高的污染風(fēng)險(xiǎn)[15]。相對而言，園林綠化廢棄物中的重金屬含量較低，它主要來源于綠地或郊區(qū)林地中綠化植物自然或養(yǎng)護(hù)過程中所產(chǎn)生的喬灌木修剪物、枯枝落葉、花園內(nèi)廢棄草花等，在清潔安全等方面更具優(yōu)勢[16]。調(diào)查顯示，北京市每年產(chǎn)生2.37×106t的園林綠化廢棄物[17]，這些廢棄物給城市生態(tài)帶來了巨大的壓力。將園林綠化廢棄物進(jìn)行堆漚處理后施用于重金屬污染土壤中，既能改善土壤環(huán)境，提高植物品質(zhì)，又能減少廢棄物的堆積[18]。

近年來，對園林綠化廢棄物利用的研究，多集中在堆肥化、生產(chǎn)新型花木基質(zhì)、生產(chǎn)有機(jī)覆蓋物等方面[19]，而有關(guān)園林綠化廢棄物堆肥(GWC)對重金屬脅迫下蔬菜生理特性影響的研究較少。鑒于此，本試驗(yàn)以種植廣泛、生長周期短的小白菜為對象，通過盆栽試驗(yàn)研究施用不同比例的GWC對鉛、鋅單一和復(fù)合污染下小白菜生物量、葉綠素、丙二醛、游離脯氨酸含量，及抗氧化酶活性的影響，探討GWC作為改良劑促進(jìn)鉛、鋅脅迫下小白菜生長，改善小白菜生理特性和提高其抗脅迫能力的可行性，為鉛、鋅污染土壤上小白菜的種植提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自北京市通州區(qū)無污染苗圃地(39°45′N，116°43′E)，取0～20 cm表層土壤，風(fēng)干，去砂石和植物殘?bào)w，過2 mm篩，備用。供試小白菜品種為京綠1號，購于京研益農(nóng)(北京)種業(yè)科技有限公司。供試GWC由北京市某園林綠化廢棄物消納中心提供，將其風(fēng)干、研磨、過2 mm篩，備用。供試土壤的基本理化性質(zhì)：pH值8.02，有機(jī)質(zhì)14.52 g·kg-1，全氮1.37 g·kg-1，堿解氮29.75 mg·kg-1，有效磷27.81 mg·kg-1，速效鉀149.48 mg·kg-1，總鉛0.58 mg·kg-1，總鋅0.99 mg·kg-1。GWC的基本理化性質(zhì)：pH值8.18，有機(jī)質(zhì)302.62 g·kg-1，全氮17.50 g·kg-1，全磷3.20 g·kg-1，全鉀6.20 g·kg-1，總鉛20.82 mg·kg-1，總鋅201.18 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)于2019年2—10月在北京林大林業(yè)科技股份有限公司的溫室中進(jìn)行。試驗(yàn)采取向供試土壤中添加外源Pb(NO3)2、Zn(NO3)2的方式來模擬鉛、鋅單一和復(fù)合污染土壤。

依據(jù)農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)(GB 15618—2018)，對于pH>7.5的土壤，鉛、鋅污染的風(fēng)險(xiǎn)篩選值分別為170、300 mg·kg-1；根據(jù)2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》，我國鉛、鋅污染以中輕度為主(300～1 000 mg·kg-1)[1]。參照上述標(biāo)準(zhǔn)，最后確定本試驗(yàn)的鉛、鋅污染水平分別為500、1 000 mg·kg-1。

將供試土壤分為3份，分別平鋪在塑料薄膜上，然后分別均勻噴灑Pb(NO3)2、Zn(NO3)2溶液，并充分混合，按照設(shè)計(jì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)模擬污染土壤，保持含水率在40%～60%，培育6個月。

在鉛、鋅單一和復(fù)合污染土壤上分別設(shè)4個GWC施用水平(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))：CK，0；D1，1%；D2，2%；D5，5%。共計(jì)12個處理，每個處理重復(fù)3次，共36盆。將GWC與污染土壤混合均勻，放入盆中(盆高15 cm，上直徑18 cm，下直徑13.5 cm，帶托盤)，每盆裝土1.5 kg。培養(yǎng)2周后播小白菜種子，當(dāng)苗高超過5 cm后每盆定苗2株。試驗(yàn)過程中定期進(jìn)行澆水、殺蟲等日常管理，保持土壤濕度在田間持水量的60%，35 d后收獲取樣，測定小白菜生理指標(biāo)。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

將收獲的小白菜樣品先用自來水清洗干凈，再用去離子水淋洗，用濾紙吸干表面水分，然后用剪刀將小白菜新鮮葉片剪碎備用。

1.3.1 生物量

采用稱量法，在剪碎葉片前稱取每盆小白菜的鮮重。

1.3.2 葉綠素含量

稱取0.1 g剪碎的新鮮小白菜葉片，置于10 mL的丙酮-乙醇(體積比1∶1)溶液中，放在黑暗處浸提24 h，待葉片完全發(fā)白后，用UV-6100紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)測定663、645 nm處的光密度值，計(jì)算葉綠素(葉綠素a+葉綠素b)含量[20]。

1.3.3 丙二醛(MDA)含量

稱取0.5 g剪碎的新鮮小白菜葉片，加5 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸溶液進(jìn)行研磨提取，研磨的勻漿經(jīng)過離心取上清液，采用硫代巴比妥酸法，用UV-6100紫外分光光度計(jì)測定532、600 nm處的光密度值[20]。

1.3.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性

稱取0.5 g剪碎的新鮮小白菜葉片，加5 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH值7.8)進(jìn)行冰浴研磨，研磨的勻漿經(jīng)過離心，取上清液即為酶提液，采用氮藍(lán)四唑(NBT)法，以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活單位(U)，利用UV-6100紫外分光光度計(jì)測定560 nm處的光密度值[21]。

1.3.5 過氧化氫酶(CAT)活性

稱取1.5 g剪碎的新鮮小白菜葉片，加5 mL 0.2 mol·L-1磷酸緩沖液(pH值7.8)進(jìn)行冰浴研磨，研磨的勻漿轉(zhuǎn)移定容至25 mL，經(jīng)過離心取上清液即為酶提液，采用紫外吸收法，以1 min內(nèi)240 nm下吸光度減少0.1的酶量為1個酶活性單位(U)，計(jì)算CAT活性[22]。

1.3.6 游離脯氨酸含量

參照李合生[21]的方法先配制脯氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后稱取0.5 g剪碎的新鮮小白菜葉片，采用磺基水楊酸法，利用UV-6100紫外分光光度計(jì)測定520 nm處的光密度值，按照制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線測算對應(yīng)的脯氨酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖，用R語言3.5.1進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)二因子方差分析，對有顯著差異(P<0.05)的，利用忠實(shí)顯著性差異(Tukey’ s HSD test)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小白菜生物量的影響

從圖1可以看出，隨著GWC施用量的增加，鉛、鋅單一和復(fù)合污染土壤上小白菜的生物量均呈上升趨勢，且均在D5處理下小白菜生物量達(dá)到最大值，分別是對照組(CK)的1.68、1.24、2.09倍。在鉛單一和鉛鋅復(fù)合污染土壤上，D2、D5處理的小白菜生物量較CK差異顯著(P<0.05)。在鋅單一污染土壤上，僅有D5處理的小白菜生物量顯著(P<0.05)高于CK?？傮w而言，GWC的施用促進(jìn)了小白菜的生長。

相同污染土壤各柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05 in the same contamination soil.The same as below.圖1 GWC對鉛、鋅污染土壤上小白菜鮮重的影響Fig.1 Effects of GWC on fresh weight of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

2.2 對小白菜葉綠素含量的影響

從圖2可以看出，隨著GWC施用量的增加，鉛、鋅單一和復(fù)合污染土壤上小白菜葉綠素含量均呈上升趨勢，且均在D5處理下小白菜葉綠素含量達(dá)到最大值，分別是CK的1.35、1.28、1.19倍。在鉛、鋅單一污染土壤上，各處理的小白菜葉綠素含量均顯著(P<0.05)高于CK。在鉛鋅復(fù)合污染土壤上，僅D5處理的小白菜葉綠素含量較CK差異顯著(P<0.05)，其余處理較CK差異不顯著。這可能是由于鉛、鋅的共同脅迫加劇了對小白菜葉綠素合成的影響，少量的GWC雖然能促進(jìn)葉綠素的合成，但作用不顯著。總體而言，GWC的施用減輕了鉛、鋅對葉綠素的毒害作用，提高了小白菜的葉綠素含量，且施用量越高，葉綠素含量增加越明顯。

圖2 GWC對鉛、鋅污染土壤上小白菜葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of GWC on chlorophyll content of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

2.3 對小白菜MDA含量的影響

如圖3所示：在鉛單一污染土壤上，隨著GWC施用量的增加，小白菜MDA含量呈下降趨勢，D5處理的小白菜MDA含量較CK顯著(P<0.05)下降了34.78%；在鋅單一污染土壤上，各處理的小白菜MDA含量無顯著差異；在鉛鋅復(fù)合污染土壤上，隨著GWC施用量的增加，小白菜MDA含量呈下降趨勢，D2、D5處理的小白菜MDA含量較CK分別顯著(P<0.05)下降了25.00%、39.29%?？傮w而言，GWC的施用減輕了鉛、鋅對小白菜產(chǎn)生的氧化脅迫，小白菜MDA含量有不同程度的下降。

圖3 GWC對鉛、鋅污染土壤上小白菜MDA含量的影響Fig.3 Effects of GWC on MDA content of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

2.4 對鉛、鋅污染土壤上小白菜SOD活性的影響

如圖4所示，GWC對鉛、鋅單一和鉛鋅復(fù)合污染土壤上小白菜的SOD活性均無顯著影響。

圖4 GWC對鉛、鋅污染土壤上小白菜SOD活性的影響Fig.4 Effects of GWC on SOD activity of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

2.5 對鉛、鋅污染土壤上小白菜CAT活性的影響

如圖5所示：在鉛單一污染土壤上，D1、D2處理的小白菜CAT活性顯著(P<0.05)高于CK，分別是CK的1.49、2.00倍；在鋅單一污染土壤上施用GWC，小白菜CAT活性升高，且D2、D5處理的小白菜CAT活性顯著(P<0.05)高于CK，分別是CK的2.14、2.06倍；在鉛鋅復(fù)合污染土壤上，各處理的小白菜CAT活性均顯著(P<0.05)高于CK，在D2處理下達(dá)到最大值，是CK的3.77倍?？傮w而言，施用GWC能減輕鉛、鋅對小白菜CAT活性的抑制作用，提高其清除體內(nèi)大量過氧化氫的能力，減輕機(jī)體遭受過氧化氫毒害的程度。

圖5 GWC對鉛、鋅污染土壤上小白菜CAT活性的影響Fig.5 Effects of GWC on CAT activity of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

2.6 對鉛、鋅污染土壤上小白菜游離脯氨酸含量的影響

如圖6所示：在鉛單一污染土壤上，隨著GWC施用量的增加，小白菜游離脯氨酸含量呈上升趨勢，且D2、D5處理的小白菜游離脯氨酸含量顯著(P<0.05)高于CK，并在D5處理下達(dá)到最大值，是CK的2.20倍；在鋅單一污染土壤上，D2、D5處理的小白菜游離脯氨酸含量顯著(P<0.05)高于CK，并于D2處理下達(dá)到最大值，是CK的1.33倍；在鉛鋅復(fù)合污染土壤上，隨著GWC施用量的增加，小白菜游離脯氨酸含量呈上升趨勢，各處理的小白菜游離脯氨酸含量均顯著(P<0.05)高于CK，并在D5處理下達(dá)到最大值，是CK的2.31倍?？傮w而言，GWC的施用減輕了鉛、鋅對游離脯氨酸合成的影響，提高了小白菜體內(nèi)的游離脯氨酸含量，有助于增強(qiáng)其抗逆性。

圖6 GWC對鉛、鋅污染土壤上小白菜游離脯氨酸含量的影響Fig.6 Effects of GWC on free proline content of pakchoi in Pb，Zn contaminated soil

3 討論

本研究表明，施用GWC有利于提高鉛、鋅單一和復(fù)合污染下小白菜生物量與葉綠素含量。施用GWC降低了鉛、鋅單一和復(fù)合污染下小白菜MDA含量，提高了鉛、鋅單一和復(fù)合污染下小白菜的CAT活性和游離脯氨酸含量，從而有利于保護(hù)鉛、鋅污染下小白菜的生長，在一定程度上增強(qiáng)了小白菜抵抗鉛、鋅脅迫的能力。

葉綠素含量與植物光合作用和氮素營養(yǎng)有密切的關(guān)系，在一定程度上可反映植物的生長狀況和光合能力。已有研究表明，鉛、鋅脅迫會導(dǎo)致小白菜葉綠素含量降低，影響小白菜正常生長[23-24]。本研究中，施用GWC提高了鉛、鋅單一和復(fù)合污染土壤上小白菜的生物量與葉綠素含量(圖1、2)，且隨著GWC施用量的增加，小白菜生物量與葉綠素含量呈上升趨勢，與Liu等[25]研究結(jié)果相似。這可能是由于不同的GWC配比造成了土壤營養(yǎng)的差異，從而導(dǎo)致小白菜生物量與葉綠素含量隨著GWC施用量增加呈遞增趨勢[26]。王意錕等[6]研究發(fā)現(xiàn)，添加腐植酸能顯著提高鉛、鋅、銅、鎘復(fù)合污染土壤上菜用大豆的生物量和葉片葉綠素含量。這主要是因?yàn)楦菜岷恤然⒘u基等具有絡(luò)合重金屬作用的官能團(tuán)，這些官能團(tuán)具有刺激作物生長的作用，能促進(jìn)作物葉綠素的合成。GWC中也含有大量的腐植酸，其表面所帶的電荷和官能團(tuán)對土壤中的鉛、鋅離子有較強(qiáng)的吸附能力[27]，能使土壤中的鉛、鋅發(fā)生鈍化，從而減輕鉛、鋅對小白菜的危害。這可能是施用GWC能提高小白菜生物量與葉綠素含量的另一個原因。

在重金屬脅迫下，植物細(xì)胞會產(chǎn)生活性氧自由基，活性氧積累會誘發(fā)膜脂過氧化。MDA是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，MDA含量可反映膜脂過氧化的程度，以間接判斷膜系統(tǒng)的受損程度[28]。本研究中，施用GWC不同限度地降低了鉛、鋅單一與復(fù)合污染土壤上小白菜的MDA含量(圖3)，緩解了鉛、鋅對小白菜的脅迫作用。這與前人研究結(jié)果是一致的。王意錕等[29]向鉛、鋅、銅、鎘復(fù)合污染土壤施用腐植酸顯著降低了豇豆葉片的MDA含量，減輕了重金屬對豇豆的氧化脅迫；李張偉等[30]使用羥基磷灰石修復(fù)鉛污染土壤，使得土壤中的小白菜MDA含量顯著下降，緩解了鉛對小白菜的脅迫作用。腐植酸和羥基磷灰石的作用相同，都是通過吸附沉淀土壤中的重金屬，減少植物對重金屬的吸收，從而減輕重金屬對植物葉片質(zhì)膜的損傷。GWC可能也是通過自身的吸附沉淀能力降低了鉛、鋅的活性[31]，從而緩解了鉛、鋅對小白菜的氧化脅迫。

SOD與CAT是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶。SOD是活性氧自由基的消除劑，能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到重要作用[32]；CAT能催化過氧化氫分解生成氧和水，使細(xì)胞免于遭受過氧化氫的毒害[33]。本研究中，施用GWC提高了鉛、鋅單一和復(fù)合污染土壤上小白菜的CAT活性(圖5)。有類似研究發(fā)現(xiàn)，納米羥基磷灰石在一定添加范圍內(nèi)可提高鉛污染土壤上小白菜的抗氧化酶活性[30]。王興明等[34]研究表明，向鉛、鋅、銅、鎘復(fù)合污染土壤上添加矸石，能顯著提高香根草體內(nèi)的抗氧化酶活性；王意錕等[29]研究發(fā)現(xiàn)，腐植酸能明顯提高重金屬復(fù)合污染土壤上豇豆的SOD活性。國外研究表明，施用膨脹土能使鉛、鎘復(fù)合污染土壤上水稻的SOD活性升高[35]。以上研究中的改良劑均通過降低土壤中重金屬活性減少了植物對重金屬的吸收，從而緩解重金屬對植物體內(nèi)抗氧化酶活性的抑制作用。GWC可能也通過降低鉛、鋅活性[36]，減輕鉛、鋅對小白菜抗氧化酶活性的抑制，提高了CAT活性，從而消除由鉛、鋅脅迫而產(chǎn)生的氧化反應(yīng)。本研究中施用GWC各處理的小白菜的SOD活性較CK差異不顯著(圖4)，說明GWC的施入對SOD活性的影響不明顯，這與Ibrahim等[37]的研究結(jié)果相似。

游離脯氨酸是植物體內(nèi)一種重要的親和性滲透調(diào)節(jié)物，在抗逆境中的主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡和增加蛋白質(zhì)的可溶性，保護(hù)生物大分子結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性和阻止氧自由基產(chǎn)生[38]。本研究中，施用GWC提高了鉛、鋅單一和復(fù)合污染土壤上小白菜的游離脯氨酸含量，且游離脯氨酸含量隨著GWC施用量的增加呈上升趨勢(圖6)。這可能是由于GWC的施入對土壤中的鉛、鋅濃度有一定的稀釋作用[25]，同時由于GWC能吸附一定的鉛、鋅[36]，從而減輕了鉛、鋅對小白菜游離脯氨酸合成的影響。這與王興明等[34]的研究結(jié)果一致，而與王意錕等[29]的研究中腐植酸、泥炭對鉛、鋅、銅、鎘復(fù)合污染土壤上豇豆脯氨酸含量的影響有差異，推測脯氨酸的變化可能與改良劑、重金屬離子和植物種類有關(guān)。