電針對脊髓損傷大鼠P2X4、IL-1β表達的影響

冀麗麗 李奕琴 付海城 倪廣寶 周建瑞

摘要：目的觀察電針對脊髓損傷大鼠模型痛行為及脊髓水平小膠質(zhì)細胞（P2X4）和白介素-1β（IL-1β）表達的影響，為針刺防治脊髓損傷后中樞性疼痛的臨床治療提供依據(jù)。方法雄性SD大鼠40只，隨機分為正常組、模型組、假手術(shù)組、電針組，每組10只。建立脊髓損傷大鼠模型，電針組取雙側(cè)腰1“夾脊穴”、“委中”，每天1次，每次20min，共治療7 d。測定大鼠熱刺激爪退縮閾值、機械縮爪閾值，用RT-PCR技術(shù)檢測大鼠脊髓P2X4mRNA及IL-1βmRNA的表達變化。結(jié)果脊髓損傷大鼠痛閾上升，脊髓水平P2X4mRNA及IL-1βmRNA表達增加。與模型組相比，電針組可以改善熱痛閾、刺痛閾（P<0.05），抑制脊髓P2X4及IL-1β表達（P<0.05）。結(jié)論電針能抑制脊髓小膠質(zhì)細胞活化及炎性因子的分泌從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：電針;脊髓損傷;中樞性疼痛;P2X4;白介素-1β（IL-1β）

【中圖分類號】R?? 【文獻標識碼】A??? 【文章編號】1673-9026（2020）04-036-03

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）對上、下行神經(jīng)通路的神經(jīng)創(chuàng)傷會導(dǎo)致感覺和運動控制受損[1]，患者常并發(fā)中樞性疼痛[2]，屬于病理性疼痛，表現(xiàn)為劇烈的、陣發(fā)性的、難以忍受的疼痛，給患者帶來極大地痛苦，嚴重影響生活質(zhì)量。P2X4是脊髓小膠質(zhì)細胞表面受體之一，在脊髓損傷后P2X4受體表達的迅速上調(diào)。炎癥因子白介素1β[3]（ Interleukin-1β，IL-1β） 在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。本實驗旨在研究電針對脊髓損傷后中樞性疼痛大鼠機械痛閾和熱痛閾以及脊髓水平P2X4和IL-1β表達的影響，為針灸治療脊髓損傷后出現(xiàn)的中樞性疼痛臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

健康Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，雄性，3月齡，體重（300±20）g，SPF級。購于湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實驗中心。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后進行實驗。飼養(yǎng)室及行為學(xué)實驗室溫度為23-25 ℃，濕度50±10%，每日早晨8：00至20：00開燈，20：00至次日8：00熄燈。

1.2 造模方法

采用公認的WADE法制造脊髓損傷后中樞性疼痛模型，用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射，麻醉大鼠，將大鼠置于俯臥位，在背部正線L1脊髓節(jié)段處沿上下各1.5cm逐層切開皮膚，在胸12-腰3之間將雙側(cè)椎旁肌肉鈍性分離，咬除胸13-腰2棘突，暴露腰1節(jié)段脊髓，應(yīng)用脊髓損傷儀將重20g、尖端直徑2mm的銅棍從15cm處墜落至脊髓，造成脊髓損傷，假手術(shù)組不造成脊髓損傷。手術(shù)傷口局部使用少許青霉素粉消炎抗菌，逐層縫合傷口。術(shù)后蘇醒后，放回籠中觀察。術(shù)后3天每日用碘伏擦拭傷口1次消炎抗菌。對SCI大鼠，人工擠壓排尿每日3次，3日后改為每日2次，直至自主排尿。

1.3 動物分組及處理

利用隨機數(shù)字表法將40只大鼠隨機分為4組：正常組、模型組、假手術(shù)組、電針組，每組10只。

①正常組（Normal group）：正常飼養(yǎng)7天。

② 模型組（Model group）：建立脊髓損傷大鼠模型，造模后正常飼養(yǎng)7天。

③假手術(shù)組（Sham group）：所有手術(shù)步驟同模型組，暴露腰1脊髓節(jié)段后不損傷脊髓，造模后正常飼養(yǎng)7天。

④電針組（Electro-acupuncture group，EA group）：模型建立后，每天電針雙側(cè)腰1“夾脊穴”、“委中”，每次20min，連續(xù)治療7天。

正常組、模型組和假手術(shù)組在治療期間，每天抓取一次，不做其他特殊處理。所有大鼠存活期滿7天后，麻醉處死。

1.4 腧穴的選擇及電針操作

選取雙側(cè)腰1“夾脊穴”（Ex-B2）、“委中”（BL 40），按照《實驗針灸學(xué)》[4]所附的常用實驗動物針灸穴位取穴。

“腰1夾脊穴”深度5㎜，“委中”深度3㎜。將同側(cè)腰1“夾脊穴”和“委中””穴相連，連接韓式穴位神經(jīng)刺激儀（6805-D型，汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司生產(chǎn)），頻率2/100 Hz，強度1～3mA（以動物肢體微顫為度），持續(xù)20 min，每天1次，連續(xù)治療7 d。

1.5 指標檢測

1.5.1? 行為學(xué)觀察

各組均在上午9：00～11：00進行行為學(xué)檢測，各組行為學(xué)檢測均在上午9：00～11：00進行，且由不了解實驗?zāi)康?、意義和實驗分組情況的固定人員進行。每日對大鼠自發(fā)痛行為學(xué)的變化（舔咬、搔抓損傷水平以下部位如后部軀干、后足、尾部等）觀察2次。

1.5.2? 熱刺激爪退縮閾值（Thermal withdrawal latency， TWL）

測量大鼠熱刺激爪退縮閾值的方法，在大鼠清醒狀態(tài)下，采用熱刺痛儀，測定術(shù)前1 天，術(shù)后3、5、7天的TWL。由以下公式計算：TWL變化百分率：TWL改變百分率（%）=（即刻痛閾-基礎(chǔ)通閾）/基礎(chǔ)痛閾×100。

1.5.3? 機械縮爪閾值（Mechanical withdrawal threshold， MWT）

在大鼠清醒狀態(tài)下，采用爪觸痛儀測定術(shù)前1天，術(shù)后3、5、7天的機械縮爪閾值。由以下公式計算：MWT變化百分率：MWT改變百分率（%）=（即刻痛閾-基礎(chǔ)通閾）/基礎(chǔ)痛閾×100。

1.5.4? 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測P2X4和IL-1β的含量

Trizol法抽提組織總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR反應(yīng)根據(jù)試劑盒說明書操作。引物序列分別為：P2X4上游引物：5`-AACATCCTCCCCAACATC-3`，下游引物：5`-CTCAACTGCCAT CTCCTG -3`，IL-1β： 上游引物 5`-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3`， 下游引物5`-TGCTGAT GTACCAGTTGGGG-3`;β-actin： 上游引物5`-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3`， 下游引5`-CGTAGAAGCATTTGCGGTGCA CGATGGAGG-3`。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s，32次反復(fù)循環(huán)擴增，最后72℃延伸10min。以β-actin為內(nèi)參照，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，用凝膠成像分析系統(tǒng)，對PT-PCR產(chǎn)物電泳條帶進行吸光度（A）值分析。

1.6統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Spss 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，所有實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準差（）表示。各組熱刺激爪退縮閾值在不同時間點的比較采用雙因素方差分析（two-way ANOVA），組間比較采用Turkey法。RT-PCR檢測中P2X4和IL-1β的含量則采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行統(tǒng)計，組間比較采用LSD法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測定

實驗期間，各組大鼠正常，在活動時未表現(xiàn)出任何的運動障礙，在站立休息時也未表現(xiàn)出喜歡用某一側(cè)肢體來承重的現(xiàn)象，沒有出現(xiàn)大小便失禁的現(xiàn)象，沒有煩躁、撕咬肢體、頻繁的搖動尾巴、食欲降低等表現(xiàn)。

2.2 熱刺激爪縮退閾值變化率

與正常組比較，假手術(shù)組各時間點TWL差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），模型組術(shù)后3、5、7 d其TWL均降低，有顯著差異（P<0.05），模型組TWL持續(xù)降低至術(shù)后7 d。與模型組相比，假手術(shù)組術(shù)后3、5、7 d的TWL均有顯著差異（P<0.05）。術(shù)后3 d電針組TWL與正常組比較有顯著差異（P<0.05），術(shù)后5、7 d與模型組比，電針治療組TWL升高，有顯著差異（P<0.05）。

2.3機械縮爪閾值（ mechanical withdrawal threshold， MWT）變化率

與正常組比較，模型組術(shù)后3、5、7天MWT下降，有顯著差異（P<0.05），假手術(shù)組沒有顯著差異（P>0.05）。與模型組比較，假手術(shù)組術(shù)后3、5、7天的MWT有顯著差異（P<0.05），電針組術(shù)后3 天 MWT與正常組比較有顯著差異（P<0.05），術(shù)后5、7天與模型組比MWT上升，有顯著差異（P<0.05）。

2.4脊髓水平P2X4 mRNA表達變化

與正常組相比，模型組P2X4 mRNA表達明顯上升（P<0.05）。假手術(shù)組中的P2X4 mRNA表達與正常組之間未見統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。假手術(shù)組與模型組之間有顯著差異（P<0.05）。電針組與模型組比較，P2X4 mRNA表達下降，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.5脊髓水平IL-1β mRNA表達變化

與正常組相比，模型組IL-1β mRNA表達明顯上升（P<0.05）。假手術(shù)組與正常組之間之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。假手術(shù)組與模型組之間有顯著差異（P<0.05）。電針組與模型組比較，IL-1βmRNA表達明顯下降（P<0.05）。結(jié)果見表4。

3討論

與臨床其他治療方法相比，針刺治療神經(jīng)病理性疼痛療效顯著、安全性高、生理干擾小、副作用小，具有其顯著的優(yōu)越性。針刺效應(yīng)主要是通過刺激腧穴來調(diào)整臟腑、調(diào)節(jié)氣血和疏通經(jīng)脈，從而發(fā)揮針刺鎮(zhèn)痛作用。夾脊穴電針能抑制前炎性細胞因子的表達，減輕過度的炎癥反應(yīng)對脊髓組織造成的繼發(fā)性損傷[5]。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“巨噬細胞”[6]。正常情況下，小膠質(zhì)細胞處于靜息狀態(tài)，表面有少量受體的表達，主要包括趨化因子受體、P2X受體（P2X receptors，P2XRS）和Toll樣受體（toll like receptors，TLRS）。脊髓損傷后受體表達上調(diào)，作用于其下游信號，促進脊髓小膠質(zhì)細胞的激活。而活化的小膠質(zhì)細胞表面表達的 P2X4受體可以誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛[7]。同時活化的小膠質(zhì)細胞可釋放大量的細胞因子、炎癥介質(zhì)和神經(jīng)活性物質(zhì)，如白介素-1β（IL-1β）[8]、腫瘤壞死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）等，上述物質(zhì)又能作用于未活化的脊髓小膠質(zhì)細胞擴大疼痛反應(yīng)[9]，引起神經(jīng)炎性反應(yīng)和神經(jīng)免疫反應(yīng)，這可能就是神經(jīng)損傷產(chǎn)生和維持疼痛的原因[10]。

本研究結(jié)果提示電針治療可以調(diào)節(jié)熱痛閾和刺痛閾，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。RT-PCR結(jié)果中，脊髓損傷后大鼠脊髓P2X4mRNA及IL-1βmRNA表達明顯上升，提示P2X4及IL-1β參與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生過程。針刺治療后脊髓中P2X4mRNA及IL-1βmRNA表達有明顯下降。

綜上所述，我們推測針刺通過抑制脊髓小膠質(zhì)細胞的激活，減少活化小膠質(zhì)細胞釋放的IL-1β等炎性因子，從而減輕脊髓損傷后出現(xiàn)的痛覺過敏。但由于本研究實驗樣本量小，觀察時間點較少，實驗結(jié)果還有待進一步證實。而且本研究只觀察了電針對 P2X4和 IL-1β 的影響，其它細胞因子可能也參與了電針緩解脊髓損傷后中樞性疼痛機制。今后如能再進行大樣本、多時間點、多細胞因子的重復(fù)性實驗，可進一步深入探討電針治療神經(jīng)病理性疼痛的作用機制。

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基金項目：十堰市引導(dǎo)性項目（17Y09）

作者簡介：冀麗麗，女，1990.02.02，湖北省十堰市，漢，碩士研究生，住院醫(yī)師，神經(jīng)康復(fù)