郭佳琦， 肖云萍， 丁旭， 解宇浩， 張嘉琪， 郝峰△

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

基于CaCC的P2ry2調(diào)節(jié)劑細(xì)胞篩選模型的建立及應(yīng)用*

郭佳琦1， 肖云萍2， 丁旭1， 解宇浩1， 張嘉琪1， 郝峰1△

（1吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，2北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132031）

構(gòu)建基于鈣激活氯離子通道（CaCC）的高通量P2Y2嘌呤受體（P2ry2）調(diào)節(jié)劑細(xì)胞篩選模型。采用RT-PCR方法驗(yàn)證Fischer大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞（FRT細(xì)胞）中P2ry2的mRNA 表達(dá)水平，切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行序列測(cè)序和比對(duì)，進(jìn)一步應(yīng)用Western blot檢測(cè)FRT細(xì)胞的P2ry2蛋白表達(dá)水平。構(gòu)建鈣激活氯離子通道ANO1和對(duì)鹵族元素敏感的黃色熒光蛋白雙突變體YFP-H148Q/I152L真核表達(dá)載體，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、抗生素篩選和有限稀釋?zhuān)@取共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞。采用倒置熒光顯微鏡觀察共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L細(xì)胞的情況，并應(yīng)用熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型的有效性；熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞模型是否可篩選P2ry2調(diào)節(jié)劑，并應(yīng)用Fura-2/AM熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化，探究胞內(nèi)Ca2+濃度與P2ry2調(diào)節(jié)劑的劑量依賴(lài)關(guān)系；用Z'因子評(píng)價(jià)本模型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。FRT細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)P2ry2；倒置熒光顯微鏡中觀察到ANO1在細(xì)胞膜上表達(dá)綠色熒光，YFP-H148Q/I152L在胞漿中表達(dá)綠色熒光，成功構(gòu)建了共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的細(xì)胞模型；熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該細(xì)胞模型可篩選P2ry2調(diào)節(jié)劑，應(yīng)用Fura-2表明該細(xì)胞模型可敏感地檢測(cè)胞漿內(nèi)鈣離子濃度的變化且Ca2+濃度與P2ry2調(diào)節(jié)劑及相對(duì)熒光強(qiáng)度呈劑量依賴(lài)關(guān)系；Z'因子為0.75，說(shuō)明該細(xì)胞模型可以高通量篩選P2ry2的調(diào)節(jié)劑且有良好的穩(wěn)定性與可重復(fù)性。成功構(gòu)建了一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便快捷高效的P2ry2調(diào)節(jié)劑細(xì)胞篩選模型，適用于P2ry2調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)。

P2Y2嘌呤受體；鈣激活氯離子通道；高通量篩選；FRT細(xì)胞

P2Y嘌呤受體（P2Y purinergic receptors， P2rys）是一類(lèi)由胞外核苷酸活化的G蛋白偶聯(lián)受體，目前已經(jīng)從人體組織細(xì)胞中克隆了7個(gè)P2ry亞單位：P2ry1、P2ry2、P2ry4、P2ry6和P2ry12~14，其中P2ry2作為P2ry的一個(gè)重要亞型，日益受到人們的重視。P2ry2廣泛分布在脾、睪丸、腎、肺、心臟和大腦中，與諸多生理功能密切相關(guān)，如冠狀動(dòng)脈平滑肌收縮、慢性支氣管炎、動(dòng)脈粥樣硬化、囊性纖維化和對(duì)腫瘤的治療等。因此P2ry2的調(diào)節(jié)劑在疾病治療中發(fā)揮重要作用， UTP作為P2ry2天然的激動(dòng)劑可以介導(dǎo)小鼠冠狀動(dòng)脈收縮［1］；地夸磷索是P2ry2激動(dòng)劑在治療干眼病中的常用藥物［2］；激活P2ry2在治療胃食管反流病、乳腺癌及心肌缺血［3-5］等疾病方面也有潛在的作用；其拮抗劑可以治療特發(fā)性肺纖維化，改善卵母細(xì)胞的發(fā)育能力，抑制炎癥反應(yīng)等［6-8］。P2ry2在許多病理?xiàng)l件下顯示出可塑性，可能是治療這些疾病的潛在靶標(biāo)。由于P2Y受體亞型重疊表達(dá)，目前發(fā)現(xiàn)的激活劑和拮抗劑大多數(shù)作用于P2Y受體，缺少P2ry2高特異性、高親和力的受體激動(dòng)劑和拮抗劑。

近年來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度常用Fura-2等Ca2+指示劑［9］，這種方法雖然相對(duì)簡(jiǎn)便，但熒光染料易累積在細(xì)胞的酸性細(xì)胞器中（稱(chēng)為隔室效應(yīng)或分室效應(yīng)），不與胞漿內(nèi)游離Ca2+結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致測(cè)量上的誤差。膜片鉗技術(shù)與熒光測(cè)鈣技術(shù)結(jié)合的光電聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)可以解決以上問(wèn)題，是運(yùn)用多種方法多方面研究生物現(xiàn)象的典范，但是這種方法缺點(diǎn)是操作復(fù)雜且重復(fù)性差。

黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein， YFP）可在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)久表達(dá)，其相對(duì)熒光強(qiáng)度高，重復(fù)性好。YFP-H148Q/I152L是對(duì)鹵族元素敏感YFP的雙突變體，已被用作表達(dá)鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)源性或外源性細(xì)胞內(nèi)I-積累的基因編碼生物傳感器，可敏感反應(yīng)鈣激活氯離子通道（calcium-activated chloride channel， CaCC）的開(kāi)放。本文報(bào)道本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的共表達(dá)鈣激活氯離子通道ANO1和YFP-H148Q/I152L的細(xì)胞模型，其原理基于CaCC功能［10］，當(dāng)P2ry2與其激動(dòng)劑結(jié)合后，通過(guò)信號(hào)通路使細(xì)胞內(nèi)的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，進(jìn)而使ANO1開(kāi)放，胞內(nèi)Cl-與胞外I-交換，引起細(xì)胞內(nèi)YFP淬滅。該細(xì)胞模型可敏感地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化，且可反復(fù)傳代、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)、高效，為高通量篩選P2ry2調(diào)節(jié)劑及研究其生理病理功能等方面提供了良好的基礎(chǔ)。

材料和方法

1　主要儀器

PCR儀（ABI）；電泳儀和ChemiDoc凝膠成像儀（Bio-Rad）；倒置熒光顯微鏡（Nikon）； Fluo Star多功能酶標(biāo)儀（BMG）。

2　細(xì)胞和主要試劑

Fischer大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞（Fischer rat thyroid cells， FRT細(xì)胞）由中國(guó)科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所關(guān)新剛教授饋贈(zèng)。RT-PCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司；PCR試劑盒和DNA Marker購(gòu)自全式金公司；瓊脂糖購(gòu)自O(shè)xoid； RIPA和DAB顯色液購(gòu)自碧云天公司；兔抗大鼠P2ry2多克隆抗體、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體和山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam； Lipofectamine 3000脂質(zhì)體、Zeocin抗生素和G418抗生素購(gòu)自Invitrogen； Fura-2/AM、P2ry2激動(dòng)劑ATP、UTP、ADP，P2ry2拮抗劑suramin、PPADS，ANO1激動(dòng)劑Eact和ANO1抑制劑NFA購(gòu)自Sigma；引物由金唯智公司合成，見(jiàn)表1。

表1　RT-PCR引物序列

3　方法

3.1RT-PCR法檢測(cè) P2ry2的mRNA表達(dá)設(shè)計(jì)P2ry1、P2ry2、P2ry4、P2ry6和P2ry12~14的引物，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的FRT細(xì)胞株，加入Trizol，按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為： 94℃ 5 min； 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 2 min， 30個(gè)循環(huán)； 72℃再延伸5 min；最終降至4℃。所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

3.2PCR產(chǎn)物切膠回收測(cè)序待凝膠尚未干燥時(shí)，用干凈的手術(shù)刀片切取含有目的條帶的凝膠，要使切下的凝膠條盡可能細(xì)，用小鑷子移入0.5 mL EP管內(nèi)并稱(chēng)重；加入3~5倍的溶膠液，50℃水浴5~10 min，保證膠塊充分溶解，將所得溶液放入吸附柱中，8 000×離心30 s后倒掉廢液；向吸附柱中加入2次漂洗液，9 000×離心30 s后倒掉廢液，并將空吸附柱離心，盡量除盡漂洗液；將吸附柱徹底晾干，放入干凈的EP管中，向吸附膜中間位置加入適量雙蒸水，離心1 min后收集DNA溶液；將所得DNA溶液送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

3.3Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞P2ry2的蛋白表達(dá)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的FRT細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解液裂解后，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后分別孵育Ⅰ抗，4℃孵育過(guò)夜。P2ry2兔抗鼠多克隆抗體稀釋比例為1∶100；β-actin單克隆抗體稀釋比例為1∶500。次日，經(jīng)洗膜后分別孵育Ⅱ抗，比例為1∶200，常溫孵育1 h，再經(jīng)洗膜后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗原抗體結(jié)合區(qū)條帶。

3.4ANO1和YFP-H148Q/I152L真核表達(dá)載體的構(gòu)建提前16 h左右消化FRT細(xì)胞，使細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染時(shí)可達(dá)到70%~80%，按照Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)，將ANO1轉(zhuǎn)染到FRT細(xì)胞中，48 h后倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞膜上可見(jiàn)綠色熒光，Zeocin抗生素篩選，2周后劃掉陰性細(xì)胞并挑選合適的單細(xì)胞克隆團(tuán)，在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)2次有限稀釋后獲得陽(yáng)性克隆細(xì)胞株，連續(xù)2次傳代觀察細(xì)胞膜上全部表達(dá)綠色熒光為穩(wěn)定表達(dá)ANO1的陽(yáng)性細(xì)胞株，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將YFP-H148Q/I152L轉(zhuǎn)染到已表達(dá)ANO1的FRT細(xì)胞中，倒置熒光顯微鏡下觀察胞漿可見(jiàn)綠色熒光信號(hào)，G418抗生素篩選，具體步驟同上，獲得ANO1和YFP-H148Q/I152L共表達(dá)的FRT細(xì)胞株。

3.5熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞模型構(gòu)建有效性將構(gòu)建好的細(xì)胞模型鋪于黑壁透明的96孔板中，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)2~3 d后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置1組對(duì)照組和2組實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照（control）組用100 μL不加鈣鎂PBS清洗3次，每孔加入50 μL的不加鈣鎂PBS，泵內(nèi)加入碘離子PBS緩沖液，觀察熒光淬滅程度；實(shí)驗(yàn)組1 （experimental group 1）用100 μL不加鈣鎂PBS清洗3次，每孔加入50 μL的ANO1激動(dòng)劑Eact （100 μmol/L），泵內(nèi)加入碘化鈉PBS緩沖液，觀察熒光淬滅程度；實(shí)驗(yàn)組2 （experimental group 2）用100 μL不加鈣鎂PBS洗3次，每孔加入50 μL的ANO1拮抗劑NFA（300 μmol/L），孵育10 min，吸出NFA，加入50 μL的Eact （100 μmol/L），泵內(nèi)加入碘化鈉PBS緩沖液，記錄熒光淬滅情況。具體設(shè)置如下：激發(fā)光波長(zhǎng)500 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)540 nm。以每秒5個(gè)點(diǎn)的速度動(dòng)態(tài)檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度，其中前2 s為基線，2 s后以280 μL/s的速度向目的孔中注入120 μL碘離子PBS緩沖液。

3.6熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞模型是否可篩選P2ry2調(diào)節(jié)劑將構(gòu)建好的細(xì)胞模型鋪于黑壁透明的96孔板中，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)2~3 d后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置1組對(duì)照組和2組實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組用100 μL不加鈣鎂PBS清洗3次，每孔加入50 μL的不加鈣鎂PBS，泵內(nèi)加入碘離子PBS緩沖液，觀察熒光淬滅程度；實(shí)驗(yàn)組1用100 μL不加鈣鎂PBS清洗3次，每孔加入50 μL的P2ry2激動(dòng)劑ATP （300 μmol/L），泵內(nèi)加入碘化鈉PBS緩沖液，觀察熒光淬滅程度；實(shí)驗(yàn)組2 用100 μL不加鈣鎂PBS洗3次，每孔加入50 μL的P2ry2拮抗劑suramin （1 000 μmol/L），孵育10 min，吸出suramin，加入50 μL的ATP （300 μmol/L），泵內(nèi)加入碘化鈉PBS緩沖液，記錄熒光淬滅情況。具體設(shè)置同上。

3.7Fura-2/AM熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化當(dāng)細(xì)胞融合至適宜密度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶和 0.02% EDTA 混合液消化細(xì)胞，然后用DMEM 液終止消化并制成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞。取細(xì)胞懸液37℃預(yù)溫5 min，加入終濃度為5 μmol/L的Fura-2/AM， 37℃恒溫避光孵育負(fù)載40 min，離心并棄上清液，用PBS清洗3次，最后用PBS重懸細(xì)胞，使用Fluo star多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)ATP引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度以340 nm熒光強(qiáng)度與380 nm熒光強(qiáng)度（F340/F380）的比值來(lái)計(jì)算。

3.8細(xì)胞模型高通量篩選的評(píng)估首先將一個(gè)黑壁透明96孔板的6列加入300 μmol/L的ATP作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)另外6列加入碘化鈉PBS緩沖液作為陰性對(duì)照，檢測(cè)96孔的Z'因子值。Z'因子只與實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性與可靠性有關(guān)而與實(shí)驗(yàn)內(nèi)容無(wú)關(guān)，因此是評(píng)估高通量篩選的一種重要指標(biāo)。Z'值可根據(jù)以下公式計(jì)算：Z'=1-3×（SDsig+SDback）/（Msig-Mback），該公式中SD代表信號(hào)（sig）或背景（back）的標(biāo)準(zhǔn)差，M代表信號(hào)（sig）或背景（back）的平均值。一般Z'因子值在0.5~1時(shí)，說(shuō)明高通量篩選模型穩(wěn)定性高。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有樣本檢測(cè)均重復(fù)3次以保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。利用GraphPad Prism 5軟件對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有樣本不服從正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　FRT細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)P2ry2

RT-PCR結(jié)果顯示，P2ry2和β-actin分別在365 bp和260 bp處出現(xiàn)特異性條帶， P2ry1、P2ry4、P2ry6和P2ry12~14均未擴(kuò)增出特異性條帶，見(jiàn)圖1A，證明FRT細(xì)胞在mRNA水平上表達(dá)P2ry2。將PCR的產(chǎn)物切膠回收送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Chromas軟件上進(jìn)行分析，并將所測(cè)核苷酸序列在NCBI-BLAST進(jìn)行比對(duì)，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的P2ry2的基因序列完全一致，見(jiàn)圖1B、C，證明所克隆DNA片段即為目的基因片段。

Western blot結(jié)果顯示， P2ry2可特異性表達(dá)，它和β-actin相對(duì)表達(dá)量均為42 kD，見(jiàn)圖1D。這證明FRT細(xì)胞在蛋白水平上表達(dá)P2ry2。

Figure 1.　Confirmation of the endogenous expression of P2ry2 in FRT cells. A: RT-PCR verification of P2ry2 mRNA level; B: sequencing results of PCR products of P2ry2; C: comparison of P2ry2 sequencing results with P2ry2 gene sequence; D: Western blot verification of P2ry2 protein expression.

2　細(xì)胞模型構(gòu)建原理及結(jié)果

當(dāng)P2ry2與其激動(dòng)劑結(jié)合后，通過(guò)信號(hào)通路使細(xì)胞內(nèi)的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，進(jìn)而使ANO1開(kāi)放，胞內(nèi)Cl-與胞外I-交換，引起細(xì)胞內(nèi)YFP淬滅，見(jiàn)圖2A。

FRT細(xì)胞膜上可見(jiàn)綠色熒光，結(jié)果顯示ANO1表達(dá)在細(xì)胞膜上；FRT細(xì)胞胞漿內(nèi)和膜上均可見(jiàn)綠色熒光證明YFP-H148Q/I152L表達(dá)在胞漿中，見(jiàn)圖2 B、C。

Figure 2.　The principles and results of cell model construction. A: the principle of cell model detection; B: the expression of ANO1 in the FRT cells (×200); C: the expression of YFP-H148Q/I152L in the FRT-ANO1 cells (×200).

3　細(xì)胞模型有效性鑒定結(jié)果

熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組只加入碘化鈉PBS緩沖液，相對(duì)熒光強(qiáng)度無(wú)顯著變化，說(shuō)明ANO1未開(kāi)放；實(shí)驗(yàn)組1 加入激動(dòng)劑Eact后，相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著下降，說(shuō)明ANO1開(kāi)放；實(shí)驗(yàn)組2 加入拮抗劑NFA孵育10 min后，再加入激動(dòng)劑Eact，相對(duì)熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，說(shuō)明ANO1未開(kāi)放。對(duì)照組與高純激動(dòng)劑組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（<0.01），對(duì)照組與NFA+Eact組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（>0.01），見(jiàn)圖3。這證明我們成功構(gòu)建了ANO1-YFP-H148Q/I152L細(xì)胞模型。

Figure 3.　Validation of cell model by fluorescence quenching kinetic test with ANO1 agonist Eact and ANO1 antagonist NFA.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs control group.

4　熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證細(xì)胞模型是否可篩選P2ry2調(diào)節(jié)劑

熒光淬滅動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組只加入碘化鈉PBS緩沖液，相對(duì)熒光強(qiáng)度無(wú)顯著變化，說(shuō)明ANO1未開(kāi)放；實(shí)驗(yàn)組1加入ATP后相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著下降，說(shuō)明ANO1開(kāi)放；實(shí)驗(yàn)組2加入拮抗劑suramin孵育10 min后，再加入激動(dòng)劑ATP，相對(duì)熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，說(shuō)明ANO1未開(kāi)放。對(duì)照組與單純激動(dòng)劑組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（<0.01）；對(duì)照組與surmain+ATP組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（>0.01），見(jiàn)圖4。證明所構(gòu)建細(xì)胞模型可篩選P2ry2調(diào)節(jié)劑。

Figure 4.　Fluorescence quenching kinetics test was used to verify the cell model was able to screen P2ry2 regulator with p2ry2 agonist ATP and P2ry2 antagonist suramin.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

5　Fura-2/AM熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果

加入不同濃度ATP后，結(jié)果表示ATP濃度越高，slope值越高，即熒光斜率值與ATP濃度呈劑量依賴(lài)關(guān)系；加入ATP后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度瞬時(shí)升高，且隨著ATP濃度的升高，Ca2+濃度越高，其濃度與ATP濃度呈劑量依賴(lài)關(guān)系。結(jié)果表明，Ca2+濃度與熒光斜率值成劑量依賴(lài)關(guān)系，見(jiàn)圖5。證明該細(xì)胞模型可敏感檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。

Figure 5.　Detection results of Fura-2 fluorescent probe method. A: dose-dependent relationship between fluorescence slope and ATP concentration; B: dose-dependent relationship between Ca2+ concentration and ATP concentration；C:relationship between Ca2+ concentration and fluorescence slope.

6　不同P2ry2調(diào)節(jié)劑與相對(duì)熒光強(qiáng)度的劑量關(guān)系

加入不同的激動(dòng)劑后，檢測(cè)到不同的熒光信號(hào)，激動(dòng)劑濃度越高，相對(duì)熒光強(qiáng)度越大，結(jié)果表明激動(dòng)劑濃度與相對(duì)熒光強(qiáng)度呈劑量依賴(lài)關(guān)系，其EC50分別為11.2、26.5和188.7 μmol/L，見(jiàn)圖6A。加入含有激活劑的碘離子PBS緩沖液后，抑制劑濃度越高，相對(duì)熒光強(qiáng)度越小，即抑制劑濃度越大抑制作用越強(qiáng)，其IC50分別為35.1和135.6 μmol/L，見(jiàn)圖6B。證明拮抗劑濃度與相對(duì)熒光強(qiáng)度呈劑量依賴(lài)關(guān)系。

Figure 6.　Dose-dependent curves of P2ry2 activator and inhibitor. A: the dose-dependent curves of P2ry2 activators; B: the dose-dependent curves of P2ry2 inhibitors.

7　Z'因子評(píng)估

通過(guò)對(duì)96孔數(shù)據(jù)分析和計(jì)算得到， SDsig=7， SDback=1， Msig=100， Mback=5， Z'=0.75，信噪比為17.48∶1，從Z'值和信噪比來(lái)看，模型可用于高通量篩選，且敏感性高，見(jiàn)圖7。

Figure 7.　Z 'factor was applied to evaluate the stability and repeatability.

討論

P2ry2作為P2ry重要的亞型，偶聯(lián)于G蛋白——Gq/11，其信號(hào)通過(guò)PLC作用于細(xì)胞膜上的PIP2，使其水解為IP3和DG。IP3使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)釋放Ca2+，同時(shí)激活PKC，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞因子磷酸化產(chǎn)生多種生理效應(yīng)，如冠狀動(dòng)脈平滑肌收縮、慢性支氣管炎、動(dòng)脈粥樣硬化、囊性纖維化和對(duì)腫瘤的治療等［11］。P2ry2在痛覺(jué)的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)中也起著重要的作用，并被認(rèn)為是未來(lái)疼痛治療的新靶點(diǎn)。目前常用的P2ry2激動(dòng)劑有UTP、ATP、ADP及2-MeSATP等，拮抗劑主要有suramin及PPADS等。目前發(fā)現(xiàn)的激動(dòng)劑對(duì)P2Y受體都有不同程度的激動(dòng)作用，其中UTP因在人體組織中會(huì)快速代謝，而無(wú)法成為P2ry2相關(guān)疾病的治療藥物； suramin和PPADS均是P2Y受體的拮抗劑，其中PPADS對(duì)P2ry2的拮抗作用相對(duì)較弱。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的P2ry2調(diào)節(jié)劑幾乎都作用于P2Y受體的其他亞型，缺乏P2ry2高度特異性、高親和力的受體激動(dòng)劑和拮抗劑，阻礙了對(duì)其功能及機(jī)制的研究。

目前常選用檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的方法來(lái)篩選P2ry2調(diào)節(jié)劑，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度方法有很多，如熒光染料探針技術(shù)，激光共聚焦顯微技術(shù)，高分辨率數(shù)字成像顯微技術(shù)，膜片鉗技術(shù)與熒光測(cè)鈣技術(shù)結(jié)合而成的光電聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)等。這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng)，價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜和重復(fù)性差等缺點(diǎn)。

因FRT內(nèi)源性表達(dá)P2ry2，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建基于鈣激活氯離子通道ANO1和對(duì)鹵族元素敏感的黃色熒光蛋白雙突變體YFP-H148Q/I152L真核表達(dá)載體的FRT細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在加入ANO1的激動(dòng)劑后，熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著下降，加入ANO1的抑制劑后，熒光信號(hào)強(qiáng)度無(wú)明顯變化，說(shuō)明成功構(gòu)建ANO1-YFP-H148Q/I152L細(xì)胞模型；在加入P2ry2的激動(dòng)劑后，熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著下降，加入P2ry2的抑制劑后，熒光信號(hào)強(qiáng)度無(wú)明顯變化，說(shuō)明本模型適用于P2ry2調(diào)節(jié)劑的篩選；細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與P2ry2激動(dòng)劑和熒光斜率值成劑量依賴(lài)關(guān)系；Z'因子值為0.75，說(shuō)明本模型適用于高通量篩選P2ry2激動(dòng)劑和拮抗劑，為探究P2ry2功能和機(jī)制提供了良好的基礎(chǔ)。

本模型為P2ry2調(diào)節(jié)劑的初篩模型，具體在應(yīng)用上也會(huì)出現(xiàn)很多問(wèn)題，以下因素可能會(huì)影響篩選結(jié)果：篩選到的激活劑可能作用于其他內(nèi)源性表達(dá)的Ca2+通道；藥物小分子進(jìn)入細(xì)胞中，自己本身影響熒光淬滅，出現(xiàn)假陽(yáng)性；有的化合物雖然抑制效果好，但不是直接作用于受體，而是使蛋白質(zhì)變性，不是選擇性抑制劑。盡管本模型有很多不足之處，但是本模型有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，為高通量篩選提供了很好的解決方法。

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的細(xì)胞模型為探究P2ry2功能和機(jī)制提供了良好的基礎(chǔ)。此外還可應(yīng)用于鈣激活氯離子通道ANO1的調(diào)節(jié)劑篩選［12］，為后續(xù)深入研究鈣激活氯離子的生理病理過(guò)程及鈣激活氯離子通道調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Haanes KA， Spray S， Syberg S， et al. New insights on pyrimidine signalling within the arterial vasculature： different roles for P2Y2 and P2Y6 receptors in large and small coronary arteries of the mouse［J］. J Mol Cell Cardiol， 2016， 93：1-11.

［2］ Lau OC， Samarawickrama C， Skalicky SE. P2Y2 receptor agonists for the treatment of dry eye disease： a review［J］. Clin Ophthalmol， 2014， 8：327-334.

［3］ Wu L， Oshima T， Fukui H， et al. Adenosine triphosphate induces P2Y2 activation and IL-8 release in human epithelial cells［J］. J Gastroenterol Hepatol， 2017， 32（7）：1341-1437.

［4］ Jin H ， Ko YS ， Kim HJ. P2Y2R-mediated inflammasome activation is involved in tumor progression in breast cancer cells and in radiotherapy-resistant breast cancer［J］. Int J Oncol， 2018， 50（5）：1953-1966.

［5］ Granado M， Amor S， Montoya JJ， et al. Altered expression of P2Y2 and P2X7 purinergic receptors in the isolated rat heart mediates ischemia-reperfusion injury［J］. Vasc Pharmacol， 2015， 73：96-103.

［6］ Müller T， Fay S， Vieira RP， et al. The purinergic receptor subtype P2Y2mediates chemotaxis of neutrophils and fibroblasts in fibrotic lung disease［J］. Oncotarget， 2017， 8（22）：35962-35972.

［7］ Fonseca E， Mesquita P， Marques CC， et al. Modulation of P2Y2 receptors in bovine cumulus oocyte complexes： effects on intracellular calcium， zona hardening and developmental competence［J］. Purinergic Signal， 2020， 16（1）：85-96.

［8］ Alberto AV， Faria RX， de Menezes JR， et al. Role of P2 receptors as modulators of rat eosinophil recruitment in allergic inflammation［J］. PLoS One， 2016， 11（1）：e0145392.

［9］ Johnson M. Calcium imaging of store-operated calcium （Ca2+） entry （SOCE） in HEK293 cells using Fura-2［J］. Methods Mol Biol， 2019， 1925：163-172.

［10］ 侯毅鞠，許會(huì)靜，張雲(yún)喬，等. 鈣激活氯通道ANO1在小鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)及其功能鑒定［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2015， 31（3）：539-542.

Hou YJ， Xu HJ， Zhang YQ， et al. Expression and identification of ANO1 in mouse cardiomgocytes［J］. Chin J Pathophysiol， 2015， 31（3）：539-542.

［11］ Molliver DC， Rau KK， Jankowski MP， et al. Deletion of the murine ATP/UTP receptor P2Y2 alters mechanical and thermal response properties in polymodal cutaneous afferents［J］. Neuroscience， 2016， 332：223-230.

［12］ 郝峰，白雪松，鞠曉紅，等. TMEM16A鈣激活氯離子通道在Fisher大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的表達(dá)及其電生理特性研究［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2014， 30（9）：1633-1639.

Hao F， Bai XS， Ju XH， et al. Expression of TMEM16A as a calcium-activated chloride channel in Fischer rat thyroid follicular epithelial cells and its electrophysiologic properties［J］. Chin J Pathophysiol， 2014， 30（9）：1633-1639.

Establishment and application of cell model for P2ry2 modulators screening based on CaCC

GUO Jia-qi1， XIAO Yun-ping2， DING Xu1， XIE Yu-hao1， ZHANG Jia-qi1， HAO Feng1

（1，，2，，132013，）

To construct a high-throughput screening cell model for P2Y2purinergic receptor （P2ry2） modulators based on calcium-activated chloride channel （CaCC）.The mRNA expression of P2ry2 in Fischer rat thyroid （FRT） cells was detected by RT-PCR， and the PCR products were collected and sequenced. The protein expression of P2ry2 in the FRT cells was also detected by Western blot. The eukaryotic expression vectors ANO1 and YFP-H148Q/I152L were constructed. The FRT cells co-expressing ANO1 and YFP-H148Q/I152L were obtained by liposome transfection， antibiotic screening and limited dilution. The expression of ANO1 and YFP-H148Q / I152L in the cells was observed under fluorescent inverted microscope. The validation of the cell model for screening P2ry2 modulators was verified by the fluorescence quenching kinetics tests， and intracellular free calcium was analyzed by Fura-2 staining to investigate the dose-dependent relationship between intracellular calcium concentration and P2ry2 modulators. Z' factor was applied to evaluate the stability and repeatability of the cell model.P2ry2 were endogenously expressed in the FRT cells. The expression of ANO1 on the cell membrane and the expression of YFP-H148Q/I152L in the cytoplasm were observed under fluorescent inverted microscope. The cell model was successfully constructed. The fluorescence quenching kinetics test confirmed the cell model for screening P2ry2 modulators was constructed successfully， and the calcium concentration in cytoplasm was increased rapidly after the addition of a small amount of P2ry2 agonist， indicating that the cell model was sensitive for detecting the calcium concentration in cytoplasm. The calcium concentration in cytoplasm， P2ry2 modulators and the slope of fluorescence change were in a dose-dependent manner， respectively. The Z' factor was 0.75， indicating that the established cell model was able to use for high-throughput screening of P2ry2 modulators with excellent stability and repeatability.A simple， economical， and efficient cell screening model of P2ry2 modulators is successfully constructed， which is suitable for the detection and evaluation of P2ry2 modulators.

P2Y2purinergic receptor； Calcium-activated chloride channel； High-throughput screening； FRT cells

R33-33； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.027

1000-4718（2020）11-2105-08

2020-03-17

2020-07-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（No.81601234）；吉林省教育廳基金資助課題（No.JJKH20170418KJ; No. JJKH20191056KJ）；吉林醫(yī)藥學(xué)院?jiǎn)?dòng)資金（No.2017KYQD001）；吉林省衛(wèi)生與健康技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（No.2018J113)；國(guó)家級(jí)和吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（No.201713743004; No.201913706071）

Tel: 0432-64561069; E-mail: haof863@126.com

（責(zé)任編輯：宋延君，余小慧）